技術(shù)原理
晚期凋亡細(xì)胞中染色體dna雙鏈或單鏈斷裂產(chǎn)生粘性3'-oh末端，在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(tdt)的催化下，將帶有熒光素分子的dutp標(biāo)記到dna的3'-末端，然后通過熒光顯微鏡觀察、或進(jìn)而用帶有hrp的一抗染色后dab顯色，可以進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測，該實驗稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, tunel)。
tunel檢測可以標(biāo)記組織細(xì)胞中發(fā)生凋亡的細(xì)胞，通過核復(fù)染計數(shù)細(xì)胞比例，可以計算一定組織細(xì)胞中發(fā)生凋亡的細(xì)胞比例，常用在各方向生物學(xué)研究中凋亡發(fā)生的檢測以及定性比較。
實驗流程
石蠟切片/冰凍切片/細(xì)胞爬片-脫蠟-通透-酶標(biāo)記反應(yīng)-hrp抗體,dab顯色，可白光拍照-核復(fù)染-觀察拍照。
實驗方法
對于貼壁細(xì)胞或細(xì)胞涂片
a. pbs或hbss洗滌一次。
b. 如果細(xì)胞貼得不牢，可以干燥樣品使細(xì)胞貼得更牢。
c. 用4%多聚甲醛或碧云天生產(chǎn)的免疫染色固定液(p0098)固定細(xì)胞30-60分鐘。
d. 用pbs或hbss洗滌一次。
e. 加入含0.1%triton x-100的pbs，冰浴孵育2分鐘。
f. 轉(zhuǎn)步驟5。
對于懸浮細(xì)胞或細(xì)胞懸液
a. 收集細(xì)胞(不超過200萬細(xì)胞)，pbs或hbss洗滌一次。
b. 用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30-60分鐘。為防止細(xì)胞聚集成團(tuán)，宜在側(cè)擺搖床或水
平搖床上緩慢搖動的同時進(jìn)行固定。
c. 用pbs或hbss洗滌一次。
d. 用含0.1% triton x-100的pbs重懸細(xì)胞，冰浴孵育2分鐘。
e. 轉(zhuǎn)步驟5。
對于石蠟切片
a. 二甲苯中脫蠟5-10分鐘。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10分鐘。無水乙醇5分鐘。90%乙醇2分鐘。70%乙醇2分鐘，蒸餾水2分鐘。
b.滴加20μg/ml不含dnase的蛋白酶k，20-37℃作用15-30分鐘(不同組織的作用溫度和時間需自行摸索)。
c. pbs或hbss洗滌3次。注意：這一步必須把蛋白酶k洗滌干凈，否則會嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)。
d. 轉(zhuǎn)步驟5。
對于冷凍切片
a. 用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30-60分鐘。
b. pbs或hbss洗滌2次，每次10分鐘。
c. 加入含0.1% triton x-100的pbs，冰浴孵育2分鐘。
d. 轉(zhuǎn)步驟5。
對于貼壁細(xì)胞、細(xì)胞涂片或組織切片
a. 用pbs或hbss洗滌2次。
b. 在樣品上加50μl tunel檢測液，37℃避光孵育60分鐘。注意：孵育時需注意在周圍用浸足水的紙或藥棉等保持濕潤，以盡量減少tunel檢測液的蒸發(fā)。
c. pbs或hbss洗滌3次。
d. 用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察?？梢允褂玫募ぐl(fā)波長范圍為450-500nm，發(fā)射波長范圍為515-565nm(綠色熒光)。
對于懸浮細(xì)胞或細(xì)胞懸液
a. 用pbs或hbss洗滌2次。
b. 加入50μl tunel檢測液，37℃避光孵育60分鐘。
c. pbs或hbss洗滌2次。
d. 用250-500μl pbs或hbss懸浮。
e. 此時可以用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測或涂片后在熒光顯微鏡下觀察?？梢允褂玫募ぐl(fā)波長范圍為450-500nm，發(fā)射波長范
圍為515-565nm(綠色熒光)。
樣本保存運(yùn)輸
實驗項目
標(biāo)本要求
標(biāo)本保存運(yùn)輸條件
可能存在風(fēng)險
建議
tunel檢測
按制作石蠟切片、冰凍切片、細(xì)胞爬片要求送樣
石蠟切片常溫、冰凍切片-20℃、固定后細(xì)胞爬片
染色結(jié)果同造模效果密切相關(guān)，正常組織可能陽性率很低
以實際結(jié)果為準(zhǔn)