中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
gb 5009.22-2016
食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
食品中黃曲霉毒素b族和g族的測(cè)定
前言
本標(biāo)準(zhǔn)代替gb/t 5009.22- 2003（食品中黃曲霉毒素b1的測(cè)定》、gb/t 5009.23-2006《食品中黃曲霉毒素b1、b2、g1、g2的測(cè)定》、gb 5009.24-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中黃曲霉毒素m1和b1的測(cè)定》.gb/t 23212-20086牛奶和奶粉中黃曲霉毒素b1、b2、g1、g2、m1、m2的測(cè)定液相色譜-熒光檢測(cè)法》、gb/t 18979-2003《食品中黃曲霉毒素的測(cè)定免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法》、sn 0339-1995《出口茶葉中黃曲霉毒素b1檢驗(yàn)方法》、sn/t 1664-2005《牛奶和奶粉中黃曲霉毒素m1、b1、b2、g1、g2含量的測(cè)定》、sn/t 1101-2002《進(jìn)出口油籽及糧谷中黃曲霉毒素的檢驗(yàn)方法》、sn 0637-1997《出口油籽、堅(jiān)果及堅(jiān)果制品中黃曲霉毒素的檢驗(yàn)方法液相色譜法》、sn/t 1736-2006進(jìn)出口蜂蜜中黃曲霉毒素的檢驗(yàn)方法高效液相色譜法》、ny/t 1286-2007《花生黃曲霉毒素b1的測(cè)定高效液相色譜法》。
本標(biāo)準(zhǔn)與gb/t 5009.22-2003相比，主要變化如下：
——標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中黃曲霉毒素b族和g族的測(cè)定”；
——根據(jù)gb 2761-2011的要求，增加了方法的適用范圍；
——增加了同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法為第一法；
——增加了高效液相色譜柱前衍生法為第二法：
——增加了高效液相色譜柱后衍生法為第三法：
——修改了酶聯(lián)免疫法，并將方法名稱更改為酶聯(lián)免疫吸附篩查法：
——增加了免疫親和柱以及酶聯(lián)免疫試劑盒質(zhì)量判定要求與方法；
——修改了測(cè)定組分為黃曲霉毒素b族和g族化合物。
1范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2（以下簡(jiǎn)稱aft b1、aft b2、aft g1和aft g2）的測(cè)定方法。
本標(biāo)準(zhǔn)第一法為同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，適用于谷物及其制品、豆類及其制品、堅(jiān)果及籽類、油脂及其制品、調(diào)味品、嬰幼兒配方食品和嬰幼兒輔助食品中aft b1、aft b2、aft g1和aft g2的測(cè)定。
本標(biāo)準(zhǔn)第二法為高效液相色譜-柱前衍生法，適用于谷物及其制品、豆類及其制品、堅(jiān)果及籽類、油脂及其制品、調(diào)味品、嬰幼兒配方食品和嬰幼兒輔助食品中aft b1、aft b2、aft g1和aft g2的測(cè)定。
本標(biāo)準(zhǔn)第三法為高效液相色譜-柱后衍生法，適用于谷物及其制品、豆類及其制品、堅(jiān)果及籽類、油脂及其制品、調(diào)味品、嬰幼兒配方食品和嬰幼兒輔助食品中aft b1、aft b2、aft g1和aft g2的測(cè)定。
本標(biāo)準(zhǔn)第四法為酶聯(lián)免疫吸附篩查法，適用于谷物及其制品、豆類及其制品、堅(jiān)果及籽類、油脂及其制品、調(diào)味品、嬰幼兒配方食品和嬰幼兒輔助食品中aft b1的測(cè)定。
本標(biāo)準(zhǔn)第五法為薄層色譜法，適用于谷物及其制品、豆類及其制品、堅(jiān)果及籽類、油脂及其制品、味品中aft b1的測(cè)定。
第一法同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法
2原理
試樣中的黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2，用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液提取，提取液用含1%triton x-100（或吐溫-20）的磷酸鹽緩沖溶液稀釋后（必要時(shí)經(jīng)黃曲霉毒素固相凈化柱初步凈化），通過(guò)免疫親和柱凈化和富集，凈化液濃縮、定容和過(guò)濾后經(jīng)液相色譜分離，串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。
3試劑和材料
除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為gb/t 6682規(guī)定的一級(jí)水。
3.1試劑
3.1.1乙腈（ch3cn）：色譜純。
3.1.2甲醇（ch3oh）：色譜純。
3.1.3乙酸銨（ch3 coonh4）：色譜純。
3.1.4氯化鈉（nacl）。
3.1.5磷酸氫二鈉（na2hpo4）。
3.1.6磷酸二氫鉀（kh2po4）。
3.1.7氯化（hua）鉀（kcl）。
3.1.8鹽酸（hcl）。
3.1.9 triton x-100[c14h22o（c2h4o）n]（或吐溫-20，c58h114o26）。
3.2試劑配制
3.2.1乙酸銨溶液（5 mmol/l）：稱取0.39 g乙酸銨，用水溶解后稀釋至1 000 ml，混勻。
3.2.2乙腈-水溶液（84+16）：取840 ml乙腈加入160 ml水，混勻。
3.2.3甲醇-水溶液（70+30）：取700 ml甲醇加入300 ml水，混勻。
3.2.4乙腈-水溶液（50+50）：取50 ml乙腈加入50 ml水，混勻。
3.2.5乙腈-甲醇溶液（50+50）：取50 ml乙腈加入50 ml甲醇，混勻。
3.2.6 10%鹽酸溶液：取1 ml鹽酸，用純水稀釋至10 ml，混勻。
3.2.7磷酸鹽緩沖溶液（以下簡(jiǎn)稱pbs）：稱取8.00 g氯化鈉、1.20 g磷酸氫二鈉（或2.92 g十二水磷酸氫二鈉）、0.20 g磷酸二氫鉀、0.20 g氯化（hua）鉀，用900 ml水溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)ph至7.4±0.1，加水稀釋至1000ml。
3.2.8 1% triton x-100（或吐溫-20）的pbs：取10 ml triton x-100（或吐溫-20），用pbs稀釋至1 000 ml。
3.3標(biāo)準(zhǔn)品
3.3.1 aft b1標(biāo)準(zhǔn)品（c17h12o6，cas：1162-65-8）：純度≥98%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
3.3.2 aft b2標(biāo)準(zhǔn)品（c17h14o6，cas：7220-81-7）：純度≥98%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
3.3.3 aft g1標(biāo)準(zhǔn)品（c17h12o7，cas：1165-39-5）：純度≥98%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
3.3.4 aft g2標(biāo)準(zhǔn)品（c17h14o7，cas：7241-98-7）：純度≥98%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
3.3.5同位素內(nèi)標(biāo)13c17-aft b1（c17h12o6，cas：1217449-45-0）：純度≥98%，濃度為0.5μg/ ml。
3.3.6同位素內(nèi)標(biāo)13c17-aft b2（c17h14o6，cas：1217470-98-8）：純度≥98%，濃度為0.5μg/ ml。
3.3.7同位素內(nèi)標(biāo)13c17-aft g1（c17h12o7，cas：1217444-07-9）：純度≥98%，濃度為0.5μg/ml。
3.3.8同位素內(nèi)標(biāo)13c17-aft g2（c17h14o7，cas：1217462-49-1）：純度≥98%，濃度為0.5μg/ml。
注：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以使用滿足溯源要求的商品化標(biāo)準(zhǔn)溶液。
3.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
3.4.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（10μg/ml）：分別稱取aft b1、aft b2、aft g1和aft g2 1 mg（精確至0.01 mg），用乙腈溶解并定容至100 ml。此溶液濃度約為10μg/ml。溶液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中后，在-20℃下避光保存，備用。臨用前進(jìn)行濃度校準(zhǔn)（校準(zhǔn)方法參見(jiàn)附錄a）。
3.4.2混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（100 ng/ml）：準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（1.0μg/ml）1.00 ml至100 ml容量瓶中，乙腈定容。此溶液密封后避光-20℃下保存，三個(gè)月有效。
3.4.3混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液（100 ng/ml）：準(zhǔn)確移取0.5μg/ml13c17-aft b1、13c17-aft b2、13c17-aft g1和13c17-aft g2各2.00 ml，用乙腈定容至10 ml。在-20℃下避光保存，備用。
3.4.4標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（100 ng/ml）10μl、50μl、100μl、200μl、500μl、800μl、1000μl至10ml容量瓶中，加入200μl 100ng/ml的同位素內(nèi)標(biāo)工作液，用初始流動(dòng)相定容至刻度，配制濃度點(diǎn)為0.1 ng/ml、0.5 ng/ml、1.0 ng/ml、2.0 ng/ml、5.0 ng/ml、8.0 ng/ml、10.0 ng/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。
4儀器和設(shè)備
4.1勻漿機(jī)。
4.2高速粉碎機(jī)。
4.3組織搗碎機(jī)。
4.4超聲波/渦旋振蕩器或搖床。
4.5天平：感量0.01 g和0.00001 g
4.6渦旋混合器。
4.7高速均質(zhì)器：轉(zhuǎn)速6 500 r/ min~24 000 r/min。
4.8離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥6 000 r/ min。
4.9玻璃纖維濾紙：快速、高載量、液體中顆粒保留1.6μm。
4.10固相萃取裝置（帶真空泵）。
4.11氮吹儀。
4.12液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：帶電噴霧離子源。
4.13液相色譜柱。
4.14免疫親和柱：aft b1柱容量≥200ng，aft b1柱回收率≥80%，aft g2的交叉反應(yīng)率≥80%（驗(yàn)證方法參見(jiàn)附錄b）。
注：對(duì)于不同批次的親和柱在使用前需進(jìn)行質(zhì)量驗(yàn)證。
4.15黃曲霉毒素專用型固相萃取凈化柱或功能相當(dāng)?shù)墓滔噍腿≈ㄒ韵潞?jiǎn)稱凈化柱）：對(duì)復(fù)雜基質(zhì)樣品測(cè)定時(shí)使用。
4.16微孔濾頭：帶0.22μm微孔濾膜（所選用濾膜應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)溶液檢驗(yàn)確認(rèn)無(wú)吸附現(xiàn)象，方可使用）。
4.17篩網(wǎng)：1 mm~2 mm試驗(yàn)篩孔徑。
4.18 ph計(jì)。
5分析步驟
使用不同廠商的免疫親和柱，在樣品上樣、淋洗和洗脫的操作方面可能會(huì)略有不同，應(yīng)該按照供應(yīng)商所提供的操作說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作。
警示：整個(gè)分析操作過(guò)程應(yīng)在指（zhi）定區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。該區(qū)域應(yīng)避光（直射陽(yáng)光）、具備相對(duì)獨(dú)立的操作臺(tái)和廢棄物存放裝置。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，操作者應(yīng)按照接觸劇毒物的要求采取相應(yīng)的保護(hù)措施。
5.1樣品制備
5.1.1液體樣品（植物油、醬油、醋等）
采樣量需大于1 l，對(duì)于袋裝、瓶裝等包裝樣品需至少采集3個(gè)包裝（同一批次或號(hào)），將所有液體樣品在一個(gè)容器中用勻漿機(jī)混勻后，其中任意的100 g（ml）樣品進(jìn)行檢測(cè)。
5.1.2固體樣品（谷物及其制品、堅(jiān)果及籽類、嬰幼兒谷類輔助食品等）
采樣量需大于1 kg，用高速粉碎機(jī)將其粉碎，過(guò)篩，使其粒徑小于2 mm孔徑試驗(yàn)篩，混合均勻后縮分至100 g，儲(chǔ)存于樣品瓶中，密封保存，供檢測(cè)用。
5.1.3半流體（腐乳、豆豉等）
采樣量需大于1 kg（l），對(duì)于袋裝、瓶裝等包裝樣品需至少采集3個(gè)包裝（同一批次或號(hào)），用組織搗碎機(jī)搗碎混勻后，儲(chǔ)存于樣品瓶中，密封保存，供檢測(cè)用。
5.2樣品提取
5.2.1液體樣品
5.2.1.1植物油脂
稱取5g試樣（精確至0.01 g）于50 ml離心管中，加入100μl同位素內(nèi)標(biāo)工作液（3.4.3）振蕩混合后靜置30 min。加入20 ml乙腈-水溶液（84+ 16）或甲醇-水溶液（70+ 30），渦旋混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20 min（或用均質(zhì)器均質(zhì)3 min），在6000 r/min下離心10 min，取上清液備用。
5.2.1.2醬油、醋
稱取5g試樣（精確至0.01 g）于50 ml.離心管中，加入125μl同位素內(nèi)標(biāo)工作液振蕩混合后靜置30 min。用乙腈或甲醇定容至25 ml（精確至0.1 ml），渦旋混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20min（或用均質(zhì)器均質(zhì)3min），在6000r/min下離心10min（或均質(zhì)后玻璃纖維濾紙過(guò)濾），取上清液備用。
5.2.2固體樣品
5.2.2.1一般固體樣品
稱取5g試樣（精確至0.01 g）于50 ml.離心管中，加入100μl同位素內(nèi)標(biāo)工作液振蕩混合后靜置30 min。加入20.0 ml乙腈-水溶液（84+16）或甲醇-水溶液（70+30），渦旋混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20 min（或用均質(zhì)器均質(zhì)3 min），在6 000 r/min下離心10 min（或均質(zhì)后玻璃纖維濾紙過(guò)濾），取上清液備用。
5.2.2.2嬰幼兒配方食品和嬰幼兒輔助食品
稱取5g試樣（精確至0.01 g）于50 ml離心管中，加入100μl同位素內(nèi)標(biāo)工作液振蕩混合后靜置30 min。加入20.0 ml乙腈-水溶液（50+ 50）或甲醇-水溶液（70+ 30），渦旋混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20 min（或用均質(zhì)器均質(zhì)3 min），在6 000 r/min下離心10 min（或均質(zhì)后玻璃纖維濾紙過(guò)濾），取上清液備用。
5.2.3半流體樣品
稱取5 g試樣（精確至0.01g）于50 ml離心管中，加入100 pμl同位素內(nèi)標(biāo)工作液振蕩混合后靜置30 min。加入20.0 ml乙腈-水溶液（84+ 16）或甲醇-水溶液（70+30），置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20 min（或用均質(zhì)器均質(zhì)3 min），在6 000 r/min下離心10 min（或均質(zhì)后玻璃纖維濾紙過(guò)濾），取上清液備用。
5.3樣品凈化
5.3.1免疫親和柱凈化
5.3.1.1.上樣液的準(zhǔn)備
準(zhǔn)確移取4 ml上清液，加入46 ml 1% trition x-100（或吐溫-20）的pbs（使用甲醇-水溶液提取時(shí)可減半加入），混勻。
5.3.1.2免疫親和柱的準(zhǔn)備
將低溫下保存的免疫親和柱恢復(fù)至室溫。
5.3.1.3試樣的凈化
待免疫親和柱內(nèi)原有液體流盡后，將上述樣液移至50 ml注射器簡(jiǎn)中，調(diào)節(jié)下滴速度，控制樣液以1 ml/min~3 ml/min的速度穩(wěn)定下滴。待樣液滴完后，往注射器筒內(nèi)加入2×10 ml水，以穩(wěn)定流速淋洗免疫親和柱。待水滴完后，用真空泵抽干親和柱。脫離真空系統(tǒng)，在親和柱下部放置10 ml刻度試管，取下50 ml的注射器簡(jiǎn)，加入2×1 ml甲醇洗脫親和柱，控制1 ml/min~3 ml/min的速度下滴，再用真空泵抽干親和柱，收集全部洗脫液至試管中。在50℃下用氮?dú)饩従彽貙⑾疵撘捍抵两?，加?.0 ml初始流動(dòng)相，渦旋30 s溶解殘留物，0.22μm濾膜過(guò)濾，收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。
5.3.2黃曲霉毒素固相凈化柱和免疫親和柱同時(shí)使用（對(duì)花椒、胡椒和辣椒等復(fù)雜基質(zhì)）
5.3.2.1凈化柱凈化
移取適量上清液，按凈化柱操作說(shuō)明進(jìn)行凈化，收集全部?jī)艋骸?br>5.3.2.2免疫親和柱凈化
用刻度移液管準(zhǔn)確吸取上述凈化液4 ml，加入46 ml. 1% trtion x- 100（或吐溫-20）的pbs[使用甲醇-水溶液提取時(shí)，加入23ml 1% trition x-100（或吐溫-20）的pbs]，混勻。按5.3.1.2和5.3.1.3處理。
注：全自動(dòng)（在線）或半自動(dòng)（離線）的固相萃取儀器可優(yōu)化操作參數(shù)后使用。
5.4液相色譜參考條件
液相色譜參考條件列出如下：
a）流動(dòng)相：a相：5 mmol/l乙酸銨溶液；b相：乙腈-甲醇溶液（50+50）；
b）梯度洗脫：32% b（0 min~0.5 min），45% b（3 min~4 min），100% b（4.2 min~4.8 min），
32% b（5.0 min~7.0 min）；
c）色譜柱：c18柱（柱長(zhǎng)100 mm，柱內(nèi)徑2.1 mm；填料粒徑1.7μm），或相當(dāng)者；
d）流速：0.3 ml/ min；
e）柱溫：40℃；
f）進(jìn)樣體積：10μl。
5.5質(zhì)譜參考條件
質(zhì)譜參考條件列出如下：
a）檢測(cè)方式：多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)（mrm）；
b）離子源控制條件：參見(jiàn)表1；
c）離子選擇參數(shù)：參見(jiàn)表2；
d）子離子掃描圖：參見(jiàn)圖c.1~圖c.8；
e）液相色譜質(zhì)譜圖：見(jiàn)圖c.9。
5.6定性測(cè)定
試樣中目標(biāo)化合物色譜峰的保留時(shí)間與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)色譜峰的保留時(shí)間相比較，變化范圍應(yīng)在±2.5%之內(nèi)。
每種化合物的質(zhì)譜定性離子必須出現(xiàn)，至少應(yīng)包括一個(gè)母離子和兩個(gè)子離子，而且同一檢測(cè)批次，對(duì)同一化合物，樣品中目標(biāo)化合物的兩個(gè)子離子的相對(duì)豐度比與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液相比，其允許偏差不超過(guò)表3規(guī)定的范圍。
5.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
在5.4.5.5的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀分析條件下，將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液由低到高濃度進(jìn)樣檢測(cè)，以aft b1、aft b2、aft g1和aft g2色譜峰與各對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)色譜峰的峰面積比值-濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，其線性相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于0.99。
5.8試樣溶液的測(cè)定
取5.3處理得到的待測(cè)溶液進(jìn)樣，內(nèi)標(biāo)法計(jì)算待測(cè)液中目標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量濃度，按第6章計(jì)算樣品中待測(cè)物的含量。待測(cè)樣液中的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，超過(guò)線性范圍則應(yīng)適當(dāng)減少取樣量重新測(cè)定。
5.9空白試驗(yàn)
不稱取試樣，按5.2和5.3的步驟做空白實(shí)驗(yàn)。應(yīng)確認(rèn)不含有干擾待測(cè)組分的物質(zhì)。
6分析結(jié)果的表述
試樣中aft b1、aft b2、aft g1和aft g2的殘留量按式（1）計(jì)算：
式中：
x——試樣中aft b1、aft b2、aft g1或aft g2的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；
ρ——進(jìn)樣溶液中aft b1、aft b2、aft g1或aft g2按照內(nèi)標(biāo)法在標(biāo)準(zhǔn)曲線中對(duì)應(yīng)的濃
度，單位為納克每毫升（ng/ml）；
v1——試樣提取液體積（植物油脂、固體、半固體按加入的提取液體積；醬油、醋按定容總體積），單位為毫升（ml）；
v3——樣品經(jīng)凈化洗脫后的最終定容體積，單位為毫升（ml）；
1000——換算系數(shù)；
v2——用于凈化分取的樣品體積，單位為毫升（ml）；
m——試樣的稱樣量，單位為克（g）。
計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。
7精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的20%。
8其他
當(dāng)稱取樣品5 g時(shí)，aft b1的檢出限為：0.03μg/kg，aft b2的檢出限為0.03μg/kg，aft g1的檢出限為0.03μg/kg，aft g2的檢出限為0.03μg/kg；aft b1的定量限為0.1μg/kg，aft b2的定量限為0.1μg/kg，aft g1的定量限為0.1μg/kg，aft g2的定量限為0.1μg/kg。
第二法高效液相色譜-柱前衍生法
9原理
試樣中的黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2，用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液的混合溶液提取，提取液經(jīng)黃曲霉毒素固相凈化柱凈化去除脂肪、蛋白質(zhì)、色素及碳水化合物等干擾物質(zhì)，凈化液用三氟乙（yi）酸柱前衍生，液相色譜分離，熒光檢測(cè)器檢測(cè)外標(biāo)法定量。
10試劑和材料
除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為gb/t 6682規(guī)定的一級(jí)水。
10.1試劑
10.1.1甲醇（ch3oh）：色譜純。
10.1.2乙睛（ch3cn）：色譜純。
10.1.3正己烷（c6h14）：色譜純。
10.1.4三氟乙（yi）酸（cf3cooh）。
10.2試劑配制
10.2.1乙腈-水溶液（84+16）：取840 ml乙腈加入160 ml水。
10.2.2甲醇-水溶液（70+30）：取700 ml甲醇加入300 ml水。
10.2.3乙腈-水溶液（50+50）：取500 ml乙腈加入500 ml水。
10.2.4乙腈-甲醇溶液（50+50）：取500 ml乙腈加入500 ml甲醇。
10.3標(biāo)準(zhǔn)品
10.3.1 aft b1標(biāo)準(zhǔn)品（c17h2o6，cas號(hào)：1162-65-8）：純度≥98%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
10.3.2 aft b2標(biāo)準(zhǔn)品（c17h14o6，cas號(hào)：7220-81-7）：純度≥98%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
10.3.3 aft g1標(biāo)準(zhǔn)品（c17h12o7，cas號(hào)：1165-39-5）：純度≥98%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
10.3.4 aft g2標(biāo)準(zhǔn)品（c17h14o7，cas號(hào)：7241-98-7）：純度≥98%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
注：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以使用滿足溯源要求的商品化標(biāo)準(zhǔn)溶液。
10.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
10.4.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（10μg/ml）：分別稱取aft b1、aft b2、aft g1和aft g2 1 mg（精確至0.01 mg），用乙腈溶解并定容至100 ml。此溶液濃度約為10μg/ml。溶液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中后，在-20℃下避光保存，備用。臨用前進(jìn)行濃度校準(zhǔn)（校準(zhǔn)方法參見(jiàn)附錄a）。
10.4.2混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（aft b1和aft g1：100 ng/ml，aft b2和aft g2：30 ng/ml）：準(zhǔn)確移取aft b1和aft g1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各1 ml，aft b2和aft g2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各300μl至100 ml容量瓶中，乙腈定容。密封后避光-20℃下保存，三個(gè)月內(nèi)有效。
10.4.3標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：分別準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液10μl、50μl、200μl、500μ、1000μl、2000μl、4000μl至10ml容量瓶中，用初始流動(dòng)相定容至刻度（含aft b1和aft g1濃度為0.1 ng/ml、0.5 ng/ml、2.0 ng/ml、5.0 ng/ml、10.0 ng/ml、20.0 ng/ml、40.0 ng/ml，aft b2和aft g2濃度為0.03 ng/ml、0.15 ng/ml、0.6 ng/ml、1.5 ng/ml、3.0 ng/ml、6.0 ng/ml、12 ng/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液）。
11儀器和設(shè)備
11.1勻漿機(jī)。
11.2高速粉碎機(jī)。
11.3組織搗碎機(jī)。
11.4超聲波/渦旋振蕩器或搖床。
11.5天平：感量0.01 g和0.00001 g。
11.6渦旋混合器。
11.7高速均質(zhì)器：轉(zhuǎn)速6 500 r/ min~24 000 r/min。
11.8離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥6 000 r/ min。
11.9玻璃纖維濾紙：快速、高載量、液體中顆粒保留1.6μm。
11.10氮吹儀。
11.11液相色譜儀：配熒光檢測(cè)器。
11.12色譜分離柱。
11.13黃曲霉毒素專用型固相萃取凈化柱（以下簡(jiǎn)稱凈化柱），或相當(dāng)者。
11.14一次性微孔濾頭：帶0.22μm微孔濾膜（所選用濾膜應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)溶液檢驗(yàn)確認(rèn)無(wú)吸附現(xiàn)象，方可使用）。
11.15篩網(wǎng)：1 mm~2 mm試驗(yàn)篩孔徑。
11.16恒溫箱。
11.17 ph計(jì)。
12分析步驟
12.1樣品制備
12.1.1液體樣品（植物油、醬油、醋等）
采樣量需大于1 l，對(duì)于袋裝、瓶裝等包裝樣品需至少采集3個(gè)包裝（同一批次或號(hào)），將所有液體樣品在一個(gè)容器中用勻漿機(jī)混勻后，其中任意的100 g（ml）樣品進(jìn)行檢測(cè)。
12.1.2固體樣品（谷物及其制品、堅(jiān)果及籽類、嬰幼兒谷類輔助食品等）
采樣量需大于1 kg，用高速粉碎機(jī)將其粉碎，過(guò)篩.使其粒徑小于2 mm孔徑試驗(yàn)篩，混合均勻后縮分至100g，儲(chǔ)存于樣品瓶中，密封保存，供檢測(cè)用。
12.1.3半流體（腐乳、豆豉等）
采樣量需大于1 kg（l），對(duì)于袋裝、瓶裝等包裝樣品需至少采集3個(gè)包裝（同一批次或號(hào)），用組織搗碎機(jī)搗碎混勻后，儲(chǔ)存于樣品瓶中密封保存，供檢測(cè)用。
12.2樣品提取
12.2.1液體樣品
12.2.1.1植物油脂
稱取5 g試樣（精確至0.01 g）于50 ml.離心管中，加入20 ml乙腈-水溶液（84+ 16）或甲醇-水溶液（70+30），渦旋混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20 min（或用均質(zhì)器均質(zhì)3 min），在6 000 r/min下離心10 min，取上清液備用。
12.2.1.2醬油、醋
稱取5 g試樣（精確至0.01 g）于50 ml離心管中，用乙腈或甲醇定容至25 ml（精確至0.1 ml），渦旋混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20min（或用均質(zhì)器均質(zhì)3min），在6000r/min下離心10 min（或均質(zhì)后玻璃纖維濾紙過(guò)濾），取上清液備用。
12.2.2固體樣品
12.2.2.1一般固體樣品
稱取5g試樣（精確至0.01 g）于50 ml離心管中，加入20.0 ml乙腈水溶液（84+16）或甲醇水溶液（70+30），渦旋混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20 min（或用均質(zhì)器均質(zhì)3 min），在6 000 r/min下離心10 min（或均質(zhì)后玻璃纖維濾紙過(guò)濾），取上清液備用。
12.2.2.2嬰幼兒配方食品和嬰幼兒輔助食品
稱取5g試樣（精確至0.01 g）于50 ml離心管中，加入20.0 ml乙腈水溶液（50+50）或甲醇水溶液（70+30），渦旋混勻，置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20 min（或用均質(zhì)器均質(zhì)3 min），在6000r/min下離心10min（或均質(zhì)后玻璃纖維濾紙過(guò)濾），取上清液備用。
12.2.3半流體樣品
稱取5g試樣（精確至0.01 g）于50 ml離心管中，加入20.0 ml乙腈-水溶液（84+16）或甲醇-水溶液（70+30），置于超聲波/渦旋振蕩器或搖床中振蕩20 min（或用均質(zhì)器均質(zhì)3 min），在6 000 r/min下離心10min（或均質(zhì)后玻璃纖維濾紙過(guò)濾），取上清液備用。
12.3樣品黃曲霉毒素固相凈化柱凈化
移取適量上清液，按凈化柱操作說(shuō)明進(jìn)行凈化，收集全部?jī)艋骸?br>12.4衍生
用移液管準(zhǔn)確吸取4.0 ml凈化液于10 ml離心管后在50℃下用氮?dú)饩従彽卮抵两?，分別加入200μl正己烷和100μl三氟乙（yi）酸，渦旋30 s，在40℃±1℃的恒溫箱中衍生15 min，衍生結(jié)束后，在50℃下用氮?dú)饩従彽貙⒀苌捍抵两桑贸跏剂鲃?dòng)相定容至1.0 ml，渦旋30 s溶解殘留物，過(guò)0.22μm濾膜，收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。
12.5色譜參考條件
色譜參考條件列出如下：
a）流動(dòng)相：a相：水.b相：乙腈-甲醇溶液（50+ 50）；
b）梯度洗脫：24% b（0 min~6 min），35% b（8.0 min~ 10.0 min），100% b（10.2 min~11.2 min），24%b（11.5 min~13.0 min）；
c）色譜柱：c18柱（柱長(zhǎng)150 mm或250 mm，柱內(nèi)徑4.6 mm，填料粒徑5.0μm），或相當(dāng)者；
d）流速：1.0 ml/min；
e）柱溫：40℃；
f）進(jìn)樣體積：50μl；
g）檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)360 nm；發(fā)射波長(zhǎng)440 nm；
h）液相色譜圖：參見(jiàn)圖d.1。
12.6樣品測(cè)定
12.6.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液由低到高濃度依次進(jìn)樣檢測(cè)，以峰面積為縱坐標(biāo)濃度為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。
12.6.2試樣溶液的測(cè)定
待測(cè)樣液中待測(cè)化合物的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，濃度超過(guò)線性范圍的樣品則應(yīng)稀釋后重新進(jìn)樣分析。
12.6.3空白試驗(yàn)
不稱取試樣，按12.2.12.3和12.4的步驟做空白實(shí)驗(yàn)。應(yīng)確認(rèn)不含有干擾待測(cè)組分的物質(zhì)。
13分析結(jié)果的表述
試樣中aft b1、aft b2、aft g1和aft g2的殘留量按式（2）計(jì)算：
式中：
x——試樣中aft b1、aft b2、aft g1或aft g2的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；
ρ——進(jìn)樣溶液中aft b1、aft b2、aft g1或aft g2按照外標(biāo)法在標(biāo)準(zhǔn)曲線中對(duì)應(yīng)的濃
度，單位為納克每毫升（ng/ml）；
v1——試樣提取液體積（植物油脂、固體、半固體按加入的提取液體積；醬油、醋按定容總體積），單位為毫升（ml）；
v3——凈化液的最終定容體積，單位為毫升（ml）；
1 000——換算系數(shù)；
v2——凈化柱凈化后的取樣液體積，單位為毫升（ml）；
m——試樣的稱樣量，單位為克（g）。
計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。
14精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的20%。
15其他
當(dāng)稱取樣品5 g時(shí)，柱前衍生法的aft b1的檢出限為0.03μg/kg，aft b2的檢出限為0.03μg/kg，aft g1的檢出限為0.03μg/kg，aft g2的檢出限為0.03μg/ kg；柱前衍生法的aft b1的定量限為0.1μg/kg，aft b2的定量限為0.1μg/kg，aft g1的定量限為0.1μg/kg，aft g2的定量限為0.1μg/kg。
第三法高效液相色譜-柱后衍生法
導(dǎo)語(yǔ)：下述方法的儀器檢測(cè)部分，包括碘或溴試劑衍生、光化學(xué)衍生、電化學(xué)衍生等柱后衍生方法，可根據(jù)實(shí)際情況，選擇其中一種方法即可。
16原理
試樣中的黃曲霉毒素b1、黃曲霉毒素b2、黃曲霉毒素g1、黃曲霉毒素g2，用乙腈水溶液或甲醇-水溶液的混合溶液提取，提取液經(jīng)免疫親和柱凈化和富集，凈化液濃縮、定容和過(guò)濾后經(jīng)液相色譜分離，柱后衍生（碘或溴試劑衍生、光化學(xué)衍生、電化學(xué)衍生等），經(jīng)熒光檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。
17試劑和材料
除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為gb/t 6682規(guī)定的一級(jí)水。
17.1試劑
17.1.1甲醇（ch3oh）：色譜純。
17.1.2乙腈（ch3cn）：色譜純。
17.1.3氯化鈉（nacl）。
17.1.4磷酸氫二鈉（na2hpo4）。
17.1.5磷酸二氫鉀（kh2po4）。
17.1.6氯化（hua）鉀（kcl）。
17.1.7鹽酸（hcl）。
17.1.8 triton x- 100[c14h22o（c2h4o）n。]（或吐溫-20，c58h114o26）。
17.1.9碘衍生使用試劑：碘（i2）。
17.1.10溴衍生使用試劑：三溴化吡啶（c5h6br3n2）。
17.1.11電化學(xué)衍生使用試劑：溴化鉀（kbr）、濃硝酸（hno3）。
17.2試劑配制
17.2.1乙腈-水溶液（84+16）：取840 ml乙腈加入160 ml水。
17.2.2甲醇水溶液（70+30）：取700 ml甲醇加入300 ml水。
17.2.3乙腈-水溶液（50+50）：取500 ml乙腈加入500 ml水。
17.2.4乙腈-水溶液（10+90）：取100 ml乙腈加入900 ml水。
17.2.5乙腈-甲醇溶液（50+50）：取500ml乙腈加入500ml甲醇。
17.2.6磷酸鹽緩沖溶液（以下簡(jiǎn)稱pbs）：稱取8.00 g氯化鈉、1.20 g磷酸氫二鈉（或2.92 g十二水磷酸氫二鈉）、0.20g磷酸二氫鉀、0.20 g氯化（hua）鉀，用900 ml水溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)ph至7.4，用水定容至1 000 ml。
17.2.7 1%triton x- 100（或吐溫20）的pbs：取10 ml triton x- 100，用pbs定容至1 000 ml。
17.2.8 0.05%碘溶液：稱取0.1 g碘，用20 ml甲醇溶解，加水定容至200 ml，用0.45μm的濾膜過(guò)濾，現(xiàn)配現(xiàn)用（僅碘柱后衍生法使用）。
17.2.9 5 mg/l三溴化吡啶水溶液：稱取5 mg三溴化吡啶溶于1 l水中，用0.45μm的濾膜過(guò)濾，現(xiàn)配現(xiàn)用（僅溴柱后衍生法使用）。
17.3標(biāo)準(zhǔn)品
17.3.1 aft b1標(biāo)準(zhǔn)品（c17h12o6，cas號(hào)：1162-65-8）：純度≥98%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
17.3.2 aft b2標(biāo)準(zhǔn)品（c17h14o6，cas號(hào)：7220-81-7）：純度≥98%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
17.3.3 aft g1標(biāo)準(zhǔn)品（c17h12o7，cas號(hào)：1165-39-5）：純度≥98%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
17.3.4 aft g2標(biāo)準(zhǔn)品（c17h14o7，cas號(hào)：7241-98-7）：純度≥98%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
注：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以使用滿足溯源要求的商品化標(biāo)準(zhǔn)溶液。
17.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
17.4.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（10 1g/ml）：分別稱取aft b1、aft b2、aft g1和aft g2 1 mg（精確至0.01 mg），用乙腈溶解并定容至100 ml。此溶液濃度約為10μg/ml。溶液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中后，在-20℃下避光保存，備用。臨用前進(jìn)行濃度校準(zhǔn)（校準(zhǔn)方法參見(jiàn)附錄a）。
17.4.2混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（aft b1和aft g1：100 ng/ml、aft b2和aft g2：30 ng/ml）：準(zhǔn)確移取aft b1，和aft g1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各1 ml，aft b2和aft g2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各300μl至100 ml容量瓶中，乙腈定容。密封后避光-20℃下保存，三個(gè)月內(nèi)有效。
17.4.3標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：分別準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液10μl、50μl、200μl、500μl、1 000μl、2000μl、4000μl至10ml容量瓶中，用初始流動(dòng)相定容至刻度（含aft b1和aft g1濃度為0.1 ng/ml、0.5 ng/ml、2.0 ng/ml、5.0 ng/ml、10.0 ng/ml、20.0 ng/ml、40.0 ng/ml，aft b2和aft g2濃度為0.03 ng/ml、0.15 ng/ml、0.6 ng/ml、1.5 ng/ml、3.0 ng/ml、6.0 ng/ml、12 ng/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液）。
18儀器和設(shè)備
18.1勻漿機(jī)。
18.2高速粉碎機(jī)。
18.3組織搗碎機(jī)。
18.4超聲波/渦旋振蕩器或搖床。
18.5天平：感量0.01 g和0.00001 g。
18.6渦旋混合器。
18.7高速均質(zhì)器：轉(zhuǎn)速6 500 r/min~24 000 r/ min。
18.8離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥6 000 r/ min。
18.9玻璃纖維濾紙：快速、高載量、液體中顆粒保留1.6 pm。
18.10固相萃取裝置（帶真空泵）。
18.11氮吹儀。
18.12液相色譜儀：配熒光檢測(cè)器（帶-般體積流動(dòng)池或者大體積流通池）。
注：當(dāng)帶大體積流通池時(shí)不需要再使用任何型號(hào)或任何方式的柱后衍生器。
18.13液相色譜柱。
18.14光化學(xué)柱后衍生器（適用于光化學(xué)柱后衍生法）。
18.15溶劑柱后衍生裝置（適用于碘或溴試劑衍生法）。
18.16電化學(xué)柱后衍生器（適用于電化學(xué)柱后衍生法）。
18.17免疫親和柱：aft b1柱容量≥200 ng，aft b1柱回收率≥80%，aft g2的交叉反應(yīng)率≥80%（驗(yàn)證方法參見(jiàn)附錄b）。
注：對(duì)于每個(gè)批次的親和柱使用前需質(zhì)量驗(yàn)證。
18.18黃曲霉毒素固相凈化柱或功能相當(dāng)?shù)墓滔噍腿≈ㄒ韵潞?jiǎn)稱凈化柱）：對(duì)復(fù)雜基質(zhì)樣品測(cè)定時(shí)使用。
18.19一次性微孔濾頭：帶0.22μm微孔濾膜（所選用濾膜應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)溶液檢驗(yàn)確認(rèn)無(wú)吸附現(xiàn)象，方可使用）。
18.20篩網(wǎng)：1 mm~2 mm試驗(yàn)篩孔徑。
19分析步驟
使用不同廠商的免疫親和柱，在樣品的上樣、淋洗和洗脫的操作方面可能略有不同，應(yīng)該按照供應(yīng)商所提供的操作說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作。
警示：整個(gè)分析操作過(guò)程應(yīng)在指（zhi）定區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。該區(qū)域應(yīng)避光（直射陽(yáng)光）、具備相對(duì)獨(dú)立的操作臺(tái)和廢棄物存放裝置。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，操作者應(yīng)按照接觸劇毒物的要求采取相應(yīng)的保護(hù)措施。
19.1樣品制備
同12.1。
19.2樣品提取
同12.2。
19.3樣品凈化
19.3.1免疫親和柱凈化
19.3.1.1.上樣液的準(zhǔn)備
準(zhǔn)確移取4 ml上述上清液，加入46 ml 1% triton x- 100（或吐溫20）的pbs（使用甲醇水溶液提取時(shí)可減半加入），混勻。
19.3.1.2免疫親和柱的準(zhǔn)備
將低溫下保存的免疫親和柱恢復(fù)至室溫。
19.3.1.3試樣的凈化
免疫親和柱內(nèi)的液體放棄后，將上述樣液移至50 ml注射器簡(jiǎn)中，調(diào)節(jié)下滴速度，控制樣液以1 ml/min~3 ml/min的速度穩(wěn)定下滴。待樣液滴完后，往注射器筒內(nèi)加入2×10 ml水，以穩(wěn)定流速淋洗免疫親和柱。待水滴完后，用真空泵抽干親和柱。脫離真空系統(tǒng)，在親和柱下部放置10 ml刻度試管，取下50 ml的注射器筒，2×1 ml甲醇洗脫親和柱.控制1 ml/min~3 ml/min的速度下滴，再用真空泵抽干親和柱，收集全部洗脫液至試管中。在50℃下用氮?dú)饩従彽貙⑾疵撘捍抵两?，用初始流?dòng)相定容至1.0 ml，渦旋30 s溶解殘留物，0.22μm濾膜過(guò)濾，收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。
19.3.2黃曲霉毒素固相凈化柱和免疫親和柱同時(shí)使用（對(duì)花椒、胡椒和辣椒等復(fù)雜基質(zhì)）
19.3.2.1凈化柱凈化
移取適量上清液，按凈化柱操作說(shuō)明進(jìn)行凈化，收集全部?jī)艋骸?br>19.3.2.2免疫親和柱凈化
用刻度移液管準(zhǔn)確吸取上部?jī)艋? ml，加入46 ml 1% triton x- 100（或吐溫-20）的pbs（使用甲醇水溶液提取時(shí)可減半加入），混勻。按19.4.1.3處理。
注：全自動(dòng)（在線）或半自動(dòng)（離線）的固相萃取儀器可優(yōu)化操作參數(shù)后使用。
19.4液相色譜參考條件
19.4.1無(wú)衍生器法（大流通池直接檢測(cè)）
液相色譜參考條件列出如下：
a）流動(dòng)相：a相，水；b相，乙腈甲醇（50+50）；
b）等梯度洗脫條件：a，65%；b，35%；
c）色譜柱：c18柱（柱長(zhǎng)100 mm，柱內(nèi)徑2.1 mm，填料粒徑1.7μm），或相當(dāng)者；
d）流速：0.3 ml/min；
e）柱溫：40℃；
f）進(jìn)樣量：10μl；
g）激發(fā)波長(zhǎng)：365 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：436 nm（aft b1、aft b2），463 nm（aft g1、aft g2）；
h）液相色譜圖見(jiàn)圖d.2。
19.4.2柱后光化學(xué)衍生法
液相色譜參考條件列出如下：
a）流動(dòng)相：a相，水；b相，乙腈-甲醇（50+50）；
b）等梯度洗脫條件：a，68%；b，32%；
c）色譜柱：c18柱（柱長(zhǎng)150 mm或250 mm，柱內(nèi)徑4.6 mm，填料粒徑5μm），或相當(dāng)者；
d）流速：1.0 ml/ min；
e）柱溫：40℃；
f）進(jìn)樣量：50μl；
g）光化學(xué)柱后衍生器；
h）激發(fā)波長(zhǎng)：360 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：440 nm；
i）液相色譜圖見(jiàn)圖d.3。
19.4.3柱后碘或溴試劑衍生法
19.4.3.1柱后碘衍生法
液相色譜參考條件列出如下：
a）流動(dòng)相：a相，水；b相，乙腈-甲醇（50 +50）；
b）等梯度洗脫條件：a，68%；b，32%；
c）色譜柱：c18柱（柱長(zhǎng)150 mm或250 mm，柱內(nèi)徑4.6 mm，填料粒徑5μm），或相當(dāng)者；
d）流速：1.0 ml/ min；
e）柱溫：40℃；
f）進(jìn)樣量：50μl；
g）柱后衍生化系統(tǒng)；
h）衍生溶液：0.05%碘溶液；
i）衍生溶液流速：0.2 ml/min；
j）衍生反應(yīng)管溫度：70℃；
k）激發(fā)波長(zhǎng)：360 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：440 nm；
l）液相色譜圖見(jiàn)圖d.4。
19.4.3.2柱后溴衍生法
液相色譜參考條件列出如下：
a）流動(dòng)相：a相，水；b相，乙腈-甲醇（50+50）；
b）等梯度洗脫條件：a，68%；b.32%；
c）色譜柱：c18柱（柱長(zhǎng)150 mm或250 mm，柱內(nèi)徑4.6 mm，填料粒徑5μm），或相當(dāng)者；
d）流速：1.0 ml/min；
e）色譜柱柱溫：40℃；
f）進(jìn)樣量：50μl；
g）柱后衍生系統(tǒng)；
h）衍生溶液：5 mg/l三溴化吡啶水溶液；
i）衍生溶液流速：0.2 ml/ min；
j）衍生反應(yīng)管溫度：70℃；
k）激發(fā)波長(zhǎng)：360 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：440 nm；
l）液相色譜圖見(jiàn)圖d.5。
19.4.4柱后電化學(xué)衍生法
液相色譜參考條件列出如下：
a）流動(dòng)相：a相，水（1 l水中含119 mg溴化鉀，350μl 4 mol/l硝酸）；b相，甲醇；
b）等梯度洗脫條件：a，60%；b，40%；
c）色譜柱：c18柱（柱長(zhǎng)150 mm或250 mm，柱內(nèi)徑4.6 mm，填料粒徑5μm），或相當(dāng)者；
d）柱溫：40℃；
e）流速：1.0 ml/min；
f）進(jìn)樣量：50μl；
g）電化學(xué)柱后衍生器：反應(yīng)池工作電流100μa；1根peek反應(yīng)管路（長(zhǎng)度50 cm，內(nèi)徑0.5 mm）；
h）激發(fā)波長(zhǎng)：360 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：440 nm；
i）液相色譜圖見(jiàn)圖d.6。
19.5樣品測(cè)定
19.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液由低到高濃度依次進(jìn)樣檢測(cè)，以峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。
19.5.2試樣溶液的測(cè)定
待測(cè)樣液中待測(cè)化合物的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，濃度超過(guò)線性范圍的樣品則應(yīng)稀釋后重新進(jìn)樣分析。
19.5.3空白試驗(yàn)
不稱取試樣，按19.3、19.4和19.5的步驟做空白實(shí)驗(yàn)。應(yīng)確認(rèn)不含有干擾待測(cè)組分的物質(zhì)。
20分析結(jié)果的表述
試樣中aft b1、aft b2、aft g1和aft g2的殘留量按式（3）計(jì)算：
式中：
x——試樣中aft b1、aft b2、aft g1或aft g2的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；
ρ——進(jìn)樣溶液中aft b1、aft b2、aft g1或aft g2按照外標(biāo)法在標(biāo)準(zhǔn)曲線中對(duì)應(yīng)的濃度，單位為納克每毫升（ng/ml）；
v1——試樣提取液體積（植物油脂、固體、半固體按加入的提取液體積；醬油、醋按定容總體積），單位為毫升（ml）；
v3——樣品經(jīng)免疫親和柱凈化洗脫后的最終定容體積，單位為毫升（ml）；
v2——用于免疫親和柱的分取樣品體積，單位為毫升（ml）；
1 000——換算系數(shù)；
m——試樣的稱樣量，單位為克（g）。
計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。
21精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的20%。
22其他
當(dāng)稱取樣品5 g時(shí)，柱后光化學(xué)衍生法、柱后溴衍生法、柱后碘衍生法、柱后電化學(xué)衍生法的aft b1的檢出限為0.03μg/kg，aft b2的檢出限為0.01μg/kg，aft g1的檢出限為0.03μg/kg，aft g2的檢出限為0.01μg/kg；無(wú)衍生器法的aft b1的檢出限為0.02μg/kg，aft b2的檢出限為0.003μg/kg、aft g1的檢出限為0.02μg/kg，aft g2的檢出限為0.003μg/kg；
柱后光化學(xué)衍生法、柱后溴衍生法、柱后碘衍生法、柱后電化學(xué)衍生法：aft b1的定量限為0.1μg/kg，aft b2的定量限為0.03μg/kg，aft g1的定量限為0.1μg/kg，aft g2的定量限為0.03μg/kg；無(wú)衍生器法：aft b1的定量限為0.05μg/kg，aft b2的定量限為0.01μg/kg，aft g1的定量限為0.05μg/kg，aft g2的定量限為0.01μg/kg。
第四法酶聯(lián)免疫吸附篩查法
23原理
試樣中的黃曲霉毒素b1用甲醇水溶液提取，經(jīng)均質(zhì)、渦旋、離心（過(guò)濾）等處理獲取上清液。被辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記或固定在反應(yīng)孔中的黃曲霉毒素b1，與試樣上清液或標(biāo)準(zhǔn)品中的黃曲霉毒素b1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合特異性抗體。在洗滌后加入相應(yīng)顯色劑顯色，經(jīng)無(wú)機(jī)酸終止反應(yīng)，于450 nm或630 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)。樣品中的黃曲霉毒素b1與吸光度在一定濃度范圍內(nèi)呈反比。
24試劑和材料
配制溶液所需試劑均為分析純，水為gb/t6682規(guī)定二級(jí)水。
按照試劑：盒說(shuō)明書(shū)所述.配制所需溶液。
所用商品化的試劑盒需按照e中所述方法驗(yàn)證合格后方可使用。
25儀器和設(shè)備
25.1微孔板酶標(biāo)儀：帶450 nm與630 nm（可選）濾光片。
25.2研磨機(jī)。
25.3振蕩器。
25.4電子天平：感量0.01 g。
25.5離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥6000 r/ min.
25.6快速定量濾紙：孔徑11μm。
25.7篩網(wǎng)：1 mm~2 mm孔徑。
25.8試劑盒所要求的儀器。
26分析步驟
26.1樣品前處理
26.1.1液態(tài)樣品（油脂和調(diào)味品）
取100g待測(cè)樣品搖勻，稱取5.0g樣品于50 ml離心管中，加入試劑盒所要求提取液，按照試紙盒說(shuō)明書(shū)所述方法進(jìn)行檢測(cè)。
26.1.2固態(tài)樣品（谷物、堅(jiān)果和特殊膳食用食品
稱取至少100 g樣品，用研磨機(jī)進(jìn)行粉碎，粉碎后的樣品過(guò)1 mm~2 mm孔徑試驗(yàn)篩。取5.0g樣品于50ml離心管中，加入試劑盒所要求提取液，按照試紙盒說(shuō)明書(shū)所述方法進(jìn)行檢測(cè)。
26.2樣品檢測(cè)
按照酶聯(lián)免疫試劑盒所述操作步驟對(duì)待測(cè)試樣（液）進(jìn)行定量檢測(cè)。
27分析結(jié)果的表述
27.1酶聯(lián)免疫試劑盒定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制
按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的計(jì)算方法或者計(jì)算機(jī)軟件，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度與吸光度變化關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
27.2待測(cè)液濃度計(jì)算
按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的計(jì)算方法以及計(jì)算機(jī)軟件，將待測(cè)液吸光度代入27.1所獲得公式，計(jì)算得待測(cè)液濃度（ρ）。
27.3結(jié)果計(jì)算
食品中黃曲霉毒素b1的含量按式（4）計(jì)算：
式中：
x——試樣中aft b1的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；
ρ——待測(cè)液中黃曲霉毒素b1的濃度，單位為微克每升（μg/l）；
v——提取液體積（固態(tài)樣品為加入提取液體積，液態(tài)樣品為樣品和提取液總體積），單位為升（l）；
f——在前處理過(guò)程中的稀釋倍數(shù)；
m——試樣的稱樣量，單位為千克（kg）。
計(jì)算結(jié)果保留小數(shù)點(diǎn)后兩位。
陽(yáng)性樣品需用第一法、第二法或第三法進(jìn)一步確認(rèn)。
28精密度
每個(gè)試樣稱取兩份進(jìn)行平行測(cè)定，以其算術(shù)平均值為分析結(jié)果。
其分析結(jié)果的相對(duì)相差應(yīng)不大于20%。
29其他
當(dāng)稱取谷物、堅(jiān)果、油脂、調(diào)味品等樣品5 g時(shí)，方法檢出限為1μg/kg，定量限為3μg/kg。
當(dāng)稱取特殊膳食用食品樣品5g時(shí)，方法檢出限為0.1μg/kg，定量限為0.3μg/kg。
第五法薄層色譜法
30原理
樣品經(jīng)提取、濃縮、薄層分離后，黃曲霉毒素b1在紫外光（波長(zhǎng)365 nm）下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，根據(jù)其在薄層上顯示熒光的最（zui）低檢出量來(lái)測(cè)定含量。
31試劑和材料
除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為gb/t6682規(guī)定的一級(jí)水。
31.1試劑
31.1.1甲醇（ch3oh）。
31.1.2正己烷（c6h14）。
31.1.3石油醚（沸程30℃~60℃或60℃~90℃）。
31.1.4三氯（lv）甲烷（chcl3）。
31.1.5苯（c6h6）。
31.1.6乙腈（ch3cn）。
31.1.7無(wú)水乙（yi）醚（c2h6o）。
31.1.8丙酮（c3h6o）。
注：以上試劑在試驗(yàn)時(shí)先進(jìn)行一次試劑空白試驗(yàn)，如不干擾測(cè)定即可使用，否則需逐一進(jìn)行重蒸。
31.1.9硅膠g：薄層層析用。
31.1.10三氟乙（yi）酸（cf3cooh）。
31.1.11無(wú)水硫酸鈉（na2so4）。
31.1.12氯化鈉（nacl）。
31.2試劑配制
31.2.1苯-乙腈溶液（98+2）：取2 ml乙腈加入98 ml苯中混勻。
31.2.2甲醇水溶液（55+45）：取550 ml甲醇加入450 ml水中混勻。
31.2.3甲醇-三氯（lv）甲烷（4+96）：取4 ml甲醇加入96 ml三氯（lv）甲烷中混勻。
31.2.4丙酮-三氯（lv）甲烷（8+92）：取8 ml丙酮加入92 ml三氯（lv）甲烷中混勻。
31.2.5次氯酸鈉溶液（消毒用）：取100 g漂白粉，加入500 ml水，攪拌均勻。另將80 g工業(yè)用碳酸鈉（na2co3·10h2o）溶于500 ml溫水中，再將兩液混合、攪拌，澄清后過(guò)濾。此濾液含次氯酸濃度約為25g/l。若用漂粉精制備，則碳酸鈉的量可以加倍。所得溶液的濃度約為50g/l。污染的玻璃儀器用10g/l氯酸鈉溶液浸泡半天或用50g/l次氯酸鈉溶液浸泡片刻后，即可達(dá)到去毒效果。
31.3標(biāo)準(zhǔn)品
aft b1標(biāo)準(zhǔn)品（c17h12o6，cas號(hào)：1162-65-8）：純度≥98%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。
31.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
31.4.1 aft b1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（10 rg/ml）：準(zhǔn)確稱取1 mg~1.2 mg aft b1標(biāo)準(zhǔn)品，先加入2 ml乙腈溶解后，再用苯稀釋至100 ml，避光，置于4℃冰箱保存，此溶液濃度約10μg/ml。
純度的測(cè)定：取5μl 10μg/ml aft b1標(biāo)準(zhǔn)溶液.滴加于涂層厚度0.25 mm的硅膠g薄層板上，用甲醇-三氯（lv）甲烷與丙酮-三氯（lv）甲烷展開(kāi)劑展開(kāi)，在紫外光燈下觀察熒光的產(chǎn)生，應(yīng)符合以下條件：
a）在展開(kāi)后，只有單一的熒光點(diǎn)，無(wú)其他雜質(zhì)熒光點(diǎn)；
b）原點(diǎn)上沒(méi)有任何殘留的熒光物質(zhì)。
31.4.2 aft b1標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確吸取1 ml標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液于10 ml容量瓶中，加苯-乙腈混合液至刻度，混勻。此溶液每毫升相當(dāng)于1.0μg aft b1。吸取1.0 ml此稀釋液，置于5 ml容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀釋至刻度.此溶液每毫升相當(dāng)于0.2μg aft b1。再吸取aft b1標(biāo)準(zhǔn)榕液（0.2μg/ml）1.0ml置于5 ml容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀釋至刻度。此溶液每毫升相當(dāng)于0.04μg aft b1。
32儀器和設(shè)備
32.1圓孔篩：2.0 mm篩孔孔徑。
32.2小型粉碎機(jī)。
32.3電動(dòng)振蕩器。
32.4全玻璃濃縮器。
32.5玻璃板：5 cm×20 cm。
32.6薄層板涂布器。
注：可選購(gòu)適用黃曲霉毒素檢測(cè)的商品化薄層板。
32.7展開(kāi)槽：長(zhǎng)25 cm，寬6 cm，高4 cm。
32.8紫外光燈：100 w~125 w，帶365 nm濾光片。
32.9微量注射器或血色素吸管。
33分析步驟
警示：整個(gè)操作需在暗室條件下進(jìn)行。
33.1樣品提取
33.1.1玉米、大米、小麥、面粉、薯干、豆類、花生、花生醬等
33.1.1.1甲法：稱取20.00 g粉碎過(guò)篩試樣（面粉、花生醬不需粉碎），置于250 ml具塞錐形瓶中，加30 ml正己烷或石油醚和100 ml甲醇水溶液，在瓶塞上涂上一層水，蓋嚴(yán)防漏。振蕩30 min，靜置片刻，以疊成折疊式的快速定性濾紙過(guò)濾于分液漏斗中，待下層甲醇水帶被分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞錐形瓶?jī)?nèi)。取20.00 ml甲醇水溶液（相當(dāng)于4g試樣）置于另一125 ml分液漏斗中，加20 ml三氯（lv）甲烷，振搖2 min，靜置分層，如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象可滴加甲醇促使分層。放出三氯（lv）甲烷層，經(jīng)盛有約10g預(yù)先用三氯（lv）甲烷濕潤(rùn)的無(wú)水硫酸鈉的定量慢速濾紙過(guò)濾于50ml蒸發(fā)皿中，再加5ml三氯（lv）甲烷于分液漏斗中，重復(fù)振搖提取，三氯（lv）甲烷層一并濾于蒸發(fā)皿中，最后用少量三氯（lv）甲烷洗過(guò)濾器，洗液并于蒸發(fā)皿中。將蒸發(fā)血放在通風(fēng)柜于65℃水浴上通風(fēng)揮干，然后放在冰盒上冷卻2 min~3 min后，準(zhǔn)確加入1 ml苯-乙腈混合液（或?qū)⑷龋╨v）甲烷用濃縮蒸餾器減壓吹氣蒸干后，準(zhǔn)確加入1 ml苯-乙腈混合液）。用帶橡皮頭的滴管的管尖將殘?jiān)浞只旌?，若有苯的結(jié)晶析出，將蒸發(fā)皿從冰盒上取出，繼續(xù)溶解、混合，晶體即消失，再用此滴管吸取上清液轉(zhuǎn)移于2 ml具塞試管中。
33.1.1.2乙法（限于玉米、大米、小麥及其制品）：稱取20.00 g粉碎過(guò)篩試樣于250 ml具塞錐形瓶中，用滴管滴加約6 ml水，使試樣濕潤(rùn)，準(zhǔn)確加入60 ml三氯（lv）甲烷，振蕩30 min，加12 g無(wú)水硫酸鈉，振搖后，靜置30 min，用疊成折疊式的快速定性濾紙過(guò)濾于100 ml具塞錐形瓶中。取12 ml濾液（相當(dāng)4 g試樣）于蒸發(fā)皿中，在65℃水浴鍋上通風(fēng)揮干，準(zhǔn)確加入1 ml苯-乙腈混合液，以下按33.1.1.1自“用帶橡皮頭的滴管的管尖將殘?jiān)浞只?.....”起依法操作。
33.1.2花生油、香油、菜油等
稱取4.00g試樣置于小燒杯中，用20 ml正己烷或石油醚將試樣移于125 ml分液漏斗中。用20 ml甲醇水溶液分次洗燒杯，洗液一并移入分液漏斗中，振搖2 min，靜置分層后，將下層甲醇水溶液移入第二個(gè)分液漏斗中，再用5 ml甲醇水溶液重復(fù)振搖提取一次，提取液一并移入第二個(gè)分液漏斗中，在第二個(gè)分液漏斗中加入20 ml三氯（lv）甲烷，以下按33.1.1.1自“振搖2 min，靜置分層......”起依法操作。
33.1.3醬油、醋
稱取10.00g試樣于小燒杯中，為防止提取時(shí)乳化，加0.4 g氯化鈉，移入分液漏斗中，用15 ml三氯（lv）甲烷分次洗滌燒杯，洗液一并移入分液漏斗中。以下按33.1.1.1自“振搖2 min，靜置分層......”起依法操作，最后加入2.5 ml苯-乙腈混合液，此溶液每毫升相當(dāng)于4 g試樣。
或稱取10.00 g試樣，置于分液漏斗中，再加12 ml甲醇（以醬油體積代替水，故甲醇與水的體積比仍約為55：45），用20 ml三氯（lv）甲烷提取，以下按33.1.1.1自“振搖2 min，靜置分層......”起依法操作。最后加入2.5 ml苯-乙腈混合液。此溶液每毫升相當(dāng)于4 g試樣。
33.1.4干醬類（包括豆豉、腐乳制品）
稱取20.00 g研磨均勻的試樣，置于250 ml具塞錐形瓶中，加入20 ml正己烷或石油醚與50 ml甲醇水溶液。振蕩30 min，靜置片刻，以疊成折疊式快速定性濾紙過(guò)濾，濾液靜置分層后，取24 ml甲醇水層（相當(dāng)8 g試樣，其中包括8 g干醬類本身約含有4 ml水的體積在內(nèi)）置于分液漏斗中，加入20 ml三氯（lv）甲烷，以下按33.1.1.1自“振搖2 min，靜置分層......”起依法操作。最后加入2 ml苯-乙腈混合液。此溶液每毫升相當(dāng)于4 g試樣。
33.2測(cè)定
33.2.1單向展開(kāi)法
33.2.1.1薄層板的制備
稱取約3 g硅膠g，加相當(dāng)于硅膠量2倍~3倍的水，用力研磨1 min~2 min至成糊狀后立即倒于涂布器內(nèi)，推成5 cm×20 cm，厚度約0.25 mm的薄層板三塊。在空氣中干燥約15 min后，在100℃活化2 h，取出，放干燥器中保存。一般可保存2 d~3 d，若放置時(shí)間較長(zhǎng)，可再活化后使用。
33.2.1.2點(diǎn)樣
將薄層板邊緣附著的吸附劑刮凈，在距薄層板下端3cm的基線上用微量注射器或血色素吸管滴加樣液。一塊板可滴加4個(gè)點(diǎn)，點(diǎn)距邊緣和點(diǎn)間距約為1 cm，點(diǎn)直徑約3 mm。在同一塊板上滴加點(diǎn)的大小應(yīng)一致，滴加時(shí)可用吹風(fēng)機(jī)用冷風(fēng)邊吹邊加。滴加樣式如下：
第一點(diǎn)：0μl aft b1標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.04μg/ ml）。
第二點(diǎn)：20μl樣液。
第三點(diǎn)：20μl樣液+10μl 0.04μg/ml aft b1標(biāo)準(zhǔn)工作液。
第四點(diǎn)：20μl樣液十10μl 0.2μg/ml aft b1標(biāo)準(zhǔn)工作液。
33.2.1.3展開(kāi)與觀察
在展開(kāi)槽內(nèi)加10 ml無(wú)水乙（yi）醚，預(yù)展12 cm，取出揮干。再于另一展開(kāi)槽內(nèi)加10 ml丙酮-三氯（lv）甲烷（8+92），展開(kāi)10 cm~12 cm，取出。在紫外光下觀察結(jié)果，方法如下。
由于樣液點(diǎn)上加滴aft b1標(biāo)準(zhǔn)工作液，可使aft b1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)與樣液中的aft b1熒光點(diǎn)重疊。如樣液為陰性，薄層板上的第三點(diǎn)中aft b1為0.0004μg，可用作檢查在樣液內(nèi)aft b1，最（zui）低檢出量是否正常出現(xiàn)：如為陽(yáng)性，則起定性作用。薄層板上的第四點(diǎn)中aft b1為0.002μg，主要起定位作用。
若第二點(diǎn)在與aft b1，標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的相應(yīng)位置上無(wú)藍(lán)紫色熒光點(diǎn)，表示試樣中aft b1含量在5μg/kg以下，如在相應(yīng)位置上有藍(lán)紫色熒光點(diǎn)，則需進(jìn)行確證試驗(yàn)。
33.2.1.4確證試驗(yàn)
為了證實(shí)薄層板上樣液熒光系由aft b1產(chǎn)生的，加滴三氟乙（yi）酸，產(chǎn)生aft b1的衍生物，展開(kāi)后此衍生物的比移值在0.1左右。于薄層板左邊依次滴加兩個(gè)點(diǎn)。
第一點(diǎn)：0.04μg/ml aft b1標(biāo)準(zhǔn)工作液10μl。
第二點(diǎn)：20μl樣液。于以上兩點(diǎn)各加一小滴三氟乙（yi）酸蓋于其上，反應(yīng)5 min后，用吹風(fēng)機(jī)吹熱風(fēng)2 min后，使熱風(fēng)吹到薄層板上的溫度不高于40℃，再于薄層板上滴加以下兩個(gè)點(diǎn)。
第三點(diǎn)：0.04μg/ml aft b1標(biāo)準(zhǔn)工作液10μl。
第四點(diǎn)：20μl樣液。
再展開(kāi)（同16.2.1.3），在紫外光燈下觀察樣液是否產(chǎn)生與aft b1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)相同的衍生物。未加三氟乙（yi）酸的三、四兩點(diǎn)，可依次作為樣液與標(biāo)準(zhǔn)的衍生物空白對(duì)照。
33.2.1.5稀釋定量
樣液中的aft b1熒光點(diǎn)的熒光強(qiáng)度如與aft b1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的最（zui）低檢出量（0.0004μg）的熒光強(qiáng)度一致，則試樣中aft b1含量即為5μg/kg。如樣液中熒光強(qiáng)度比最（zui）低檢出量強(qiáng)，則根據(jù)其強(qiáng)度估計(jì)減少滴加微升數(shù)或?qū)右合♂尯笤俚渭硬煌⑸龜?shù)，直至樣液點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與最（zui）低檢出量的熒光強(qiáng)度一致為止。滴加式樣如下：
第一點(diǎn)：10μl aft b1標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.04μg/ml）
第二點(diǎn)：根據(jù)情況滴加10μl樣液。
第三點(diǎn)：根據(jù)情況滴加15μl樣液。
第四點(diǎn)：根據(jù)情況滴加20μl樣液。
33.2.1.6結(jié)果計(jì)算
試樣中aft b1的含量按式（5）計(jì)算：
式中：
x——試樣中aft b1的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；
0.000 4——aft b1的最（zui）低檢出量，單位為微克（g）；
v1——加入苯-乙腈混合液的體積，單位為毫升（ml）；
f——樣液的總稀釋倍數(shù)；
v2——出現(xiàn)最（zui）低熒光時(shí)滴加樣液的體積，單位為毫升（ml）；
m——加入苯-乙腈混合液溶解時(shí)相當(dāng)試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；
1 000——換算系數(shù)。
結(jié)果表示到測(cè)定值的整數(shù)位。
33.2.2雙向展開(kāi)法
如用單向展開(kāi)法展開(kāi)后，薄層色譜由于雜質(zhì)干擾掩蓋了aft b1的熒光強(qiáng)度，需采用雙向展開(kāi)法。薄層板先用無(wú)水乙（yi）醚作橫向展開(kāi)，將干擾的雜質(zhì)展至樣液點(diǎn)的一邊而aft b1不動(dòng)，然后再用丙酮-三氯（lv）甲烷（8+92）作縱向展開(kāi)，試樣在aft b1相應(yīng)處的雜質(zhì)底色大量減少，因而提高了方法靈敏度。如用雙向展開(kāi)中滴加兩點(diǎn)法展開(kāi)仍有雜質(zhì)干擾時(shí)，則可改用滴加一點(diǎn)法。
33.2.2.1滴如兩點(diǎn)法
33.2.2.1.1點(diǎn)樣
取薄層板三塊，在距下端3 cm基線上滴加aft b1，標(biāo)準(zhǔn)使用液與樣液。即在三塊板的距左邊緣0.8 cm~1 cm處各滴加10 l aft b1標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04μg/ml），在距左邊緣2.8 cm~3 cm處各滴加20μl樣液，然后在第二塊板的樣液點(diǎn)上加滴10μl aft b1標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04μg/ml），在第三塊板的樣液點(diǎn)上加滴10μl 0.2μ/ml aft b1標(biāo)準(zhǔn)使用液。
33.2.2.1.2展開(kāi)
33.2.2.1.2.1橫向展開(kāi)：在展開(kāi)槽內(nèi)的長(zhǎng)邊置一玻璃支架，加10 ml無(wú)水乙醇，將上述點(diǎn)好的薄層板靠標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的長(zhǎng)邊置于展開(kāi)槽內(nèi)展開(kāi)，展至板端后，取出揮干，或根據(jù)情況需要時(shí)可再重復(fù)展開(kāi)1次~2次。
33.2.2.1.2.2縱向展開(kāi)：揮干的薄層板以丙酮-三氯（lv）甲烷（8+92）展開(kāi)至10 cm~12 cm為止。丙酮與三氯（lv）甲烷的比例根據(jù)不同條件自行調(diào)節(jié)。
33.2.2.1.3觀察及評(píng)定結(jié)果
在紫外光燈下觀察第一、二板，若第二板的第二點(diǎn)在aft b1，標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的相應(yīng)處出現(xiàn)最（zui）低檢出量，而第一板在與第二板的相同位置上未出現(xiàn)熒光點(diǎn)，則試樣中aft b1含量在5μg/kg以下。
若第一板在與第二板的相同位置上出現(xiàn)熒光點(diǎn)，則將第一板與第三板比較，看第三板上第二點(diǎn)與第一板上第二點(diǎn)的相同位置上的熒光點(diǎn)是否與aft b1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊，如果重疊，再進(jìn)行確證試驗(yàn)。在具體測(cè)定中，第一、二、三板可以同時(shí)做，也可按照順序做。如按順序做，當(dāng)在第一板出現(xiàn)陰性時(shí)，第三板可以省略，如第一板為陽(yáng)性，則第二板可以省略，直接作第三板。
33.2.2.1.4確證試驗(yàn)
另取薄層板兩塊，于第四、第五兩板距左邊緣0.8 cm~1 cm處各滴加10μl aft b1，標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04μg/ml）及1小滴三氟乙（yi）酸；在距左邊緣2.8 cm~3 cm處，于第四板滴加20μl樣液及1小滴三氟乙（yi）酸，于第五板滴加20μl樣液、10μl aft b1標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04μg/ml）及1小滴三氟乙（yi）酸。反應(yīng)5 min后，用吹風(fēng)機(jī)吹熱風(fēng)2 min，使熱風(fēng)吹到薄層極上的溫度不高于40℃。再用雙向展開(kāi)法展開(kāi)后，觀察樣液是否產(chǎn)生與aft b1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊的衍生物。觀察時(shí)，可將第一板作為樣液的衍生物空白板。如樣液aft b1含量高時(shí)，則將樣液稀釋后，按33.2.1.4做確證試驗(yàn)。
33.2.2.1.5稀釋定量
如樣液aft b1含量高時(shí)，按16.3.1.5稀釋定量操作。如aft b1含量低，稀釋倍數(shù)小，在定量的縱向展開(kāi)板上仍有雜質(zhì)干擾，影響結(jié)果的判斷，可將樣液再做雙向展開(kāi)法測(cè)定，以確定含量。
33.2.2.1.6結(jié)果計(jì)算
同33.2.1.6。
33.2.2.2滴加一點(diǎn)法
33.2.2.2.1點(diǎn)樣
取薄層板三塊，在距下端3 cm基線上滴加aft b1標(biāo)準(zhǔn)使用液與樣液。即在三塊板臣左邊緣0.8cm~1 cm處各滴加20μl樣液，在第二板的點(diǎn)上加10μl aft b1標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04μg/ml）。在第三板的點(diǎn)上加滴10μl aft b1標(biāo)準(zhǔn)榕液（0.2μg /ml）。
33.2.2.2.2展開(kāi)
同33.2.2.1.2的橫向展開(kāi)與縱向展開(kāi)。
33.2.2.2.3觀察及評(píng)定結(jié)果
在紫外光燈下觀察第一、二板，如第二板出現(xiàn)最（zui）低檢出量的黃曲霉霉素b1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，而第一板與其相同位置上來(lái)出現(xiàn)熒光點(diǎn)，試樣中aft b1含量在5μg/kg以下。如第一板在與第二板aft b1相同位置上出現(xiàn)熒光點(diǎn)，則將第一板與第三板比較，看第三板上與第一板相同位置的熒光點(diǎn)是否與aft b1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊，如果重疊再進(jìn)行以下確證試驗(yàn)。
33.2.2.2.4確證試驗(yàn)
另取兩板，于距左邊緣0.8 cm~1 cm處，第四板滴加20μl樣液、1滴三氟乙（yi）酸；第五板滴加20μl樣液、10μl 0.04μg/ml aft b1標(biāo)準(zhǔn)使用液及1滴三氟乙（yi）酸。產(chǎn)生衍生物及展開(kāi)方法同33.2.2.1。再將以上二板在紫外光燈下觀察，以確定樣液點(diǎn)是否產(chǎn)生與aft b1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊的衍生物，觀察時(shí)可將第一板作為樣液的衍生物空白板。經(jīng)過(guò)以上確證試驗(yàn)定為陽(yáng)性后，再進(jìn)行稀釋定量，如含aft b1低，不需稀釋或稀釋倍數(shù)小，雜質(zhì)熒光仍有嚴(yán)重干擾，可根據(jù)樣液中黃曲霉毒素b1熒光的強(qiáng)弱，直接用雙向展開(kāi)法定量。
33.2.2.2.5結(jié)果計(jì)算
同33.2.1.6。
34精密度
每個(gè)試樣稱取兩份進(jìn)行平行測(cè)定，以其算術(shù)平均值為分析結(jié)果。
其分析結(jié)果的相對(duì)相差應(yīng)不大于60%。
35其他
薄層板上黃曲霉毒素b1的最（zui）低檢出量為0.000 4μg，檢出限為5μg/kg。