第三代細(xì)胞暴露染毒系統(tǒng)cultex rfs compact，細(xì)胞氣液界面的直接暴露。在過(guò)去的幾十年里，大氣污染表現(xiàn)出驚人的速度?？諝庵蓄w粒物濃度的急劇增加導(dǎo)致了呼吸道急性或慢性**的影響。在傳統(tǒng)研究中，是通過(guò)動(dòng)物的吸入暴露實(shí)驗(yàn)，確定可吸入物質(zhì)對(duì)健康的影響。到目前為止，用于探討替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究方法，還比較少。
一種在氣-液界面，空氣與細(xì)胞直接接觸的實(shí)驗(yàn)方法，由cultex公司aufderheide教授提出。細(xì)胞頂部表面直接暴露于一個(gè)恒流的大氣環(huán)境中，底部有培養(yǎng)基供給，并有恒定溫度及co2環(huán)境。2009年，cultex公司提出了經(jīng)典的輻射流氣道設(shè)計(jì)（radial flow system -cultex® rfs)，cultex rfs被譽(yù)為細(xì)胞體外暴露方法中*成功的技術(shù)。
2014年，cultex公司推出第三代細(xì)胞暴露染毒系統(tǒng)cultex rfs compact，細(xì)胞氣液界面的直接暴露。在rfs技術(shù)基礎(chǔ)上，compact增加了細(xì)胞培養(yǎng)暴露腔室數(shù)量，共計(jì)6個(gè)cell cultureinserts，并分為兩組，可對(duì)其中一組（三個(gè)cellculture inserts）進(jìn)行霧霾顆粒物暴露，另一組進(jìn)行清潔空氣暴露的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，或6個(gè)腔室全部進(jìn)行受試物/潔凈空氣的暴露實(shí)驗(yàn)。
第三代細(xì)胞暴露染毒系統(tǒng)cultex rfs compact，細(xì)胞氣液界面的直接暴露系統(tǒng)內(nèi)，6腔室徑向分布，保證顆粒物均勻的分布到每個(gè)腔室。電加熱系統(tǒng)為細(xì)胞體外培養(yǎng)提供*佳溫度條件，專門的co2接入單元保證細(xì)胞進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的體外暴露。系統(tǒng)集成到一個(gè)帶有緊鎖裝置的支架中，保證系統(tǒng)的氣密性。cultex rfs compact經(jīng)過(guò)cultex實(shí)驗(yàn)室對(duì)不同受試物質(zhì)氣溶膠的劑量反應(yīng)（dose-response），及不同暴露時(shí)間對(duì)受試物質(zhì)細(xì)胞毒性的劑量依賴（dose-dependent）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明其具有高度的實(shí)驗(yàn)重復(fù)性及可靠性。
第三代細(xì)胞暴露染毒系統(tǒng)cultex rfs compact，細(xì)胞氣液界面的直接暴露的研究材料和方法
1、 cultex rfscompact
2、 6.5mm或12mm的細(xì)胞培養(yǎng)小室（cell culture inserts）
3、 bronkhorst高精度mfc
4、 培養(yǎng)基灌注系統(tǒng)
5、 細(xì)胞株（atcc：ccl-185）和分離的原代正常人支氣管上皮細(xì)胞（nhbe）
圖 1: 兩種氣路分布的cultex® rfs compact
左圖: 三個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)小室（cell culture inserts）暴露于受試氣溶膠，另外三個(gè)平行暴露于潔凈空氣
右圖: 六個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)小室（cell culture inserts）全部暴露于受試氣溶膠或潔凈空氣
顆粒物暴露實(shí)驗(yàn)在cultex® rfs compact中進(jìn)行，細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)小室中（well cell culture insert，costar®/corning），在氣-液界面直接接觸暴露顆粒物24小時(shí)。在實(shí) 驗(yàn)過(guò)程中，細(xì)胞底部持續(xù)供給培養(yǎng)基，并通過(guò)電加熱系統(tǒng)保證環(huán)境穩(wěn)定在37°c。
香煙煙霧（全煙氣/氣相-k3r4f）和1.6%尼古丁液（***）作為受試物質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞暴露實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果
用wst-1法測(cè)定細(xì)胞活性。對(duì)于電子香煙的細(xì)胞暴露，同時(shí)分析細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。暴露24后進(jìn)行結(jié)果分析。結(jié)果與清潔空氣控制組進(jìn)行對(duì)比（圖2和圖3）。兩組之間存在顯著差異，而符號(hào)（星號(hào)）定義如下：
****p < 0.0001非常顯著, *** p = 0.0001 – 0.001 非常顯著,
** p = 0.001 – 0.01 很顯著, *p = 0.01 – 0.05 顯著
圖2: 采用wst-1分析法分析香煙煙氣（全煙氣/氣相）對(duì)a549細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。結(jié)果與潔凈空氣控制組的對(duì)比。data are given as means + s.d. from 3independent experiments with 3 samples each.
對(duì)比清潔空氣，10支香煙主流煙氣降低a549細(xì)胞的活性。隨著更多數(shù)量煙氣的暴露，細(xì)胞活性逐漸減小，同時(shí)全煙對(duì)細(xì)胞活性的影響更加明顯，相比煙氣相。暴露在清潔空氣中的細(xì)胞與細(xì)胞孵化箱中細(xì)胞的活性未有明顯變化。
圖3: 香煙煙霧和1.6%尼古丁液（***）對(duì)nhbe暴露后的細(xì)胞毒性作用和氧化應(yīng)激反應(yīng)。結(jié)果與潔凈空氣控制組的對(duì)比。data are given as means + s.d. from 3independent experiments with 3 samples each.
對(duì)nhbe細(xì)胞，細(xì)胞活力和氧化應(yīng)激水平的影響是相對(duì)的。暴露于***液的細(xì)胞，細(xì)胞活性降低并氧化應(yīng)激水平的增加。主流煙氣的暴露，細(xì)胞的更低存活率和更高的氧化應(yīng)激。清潔空氣控制組的細(xì)胞比孵化器內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞表現(xiàn)出較高的氧化應(yīng)激，這是由于清潔空氣氣流對(duì)細(xì)胞的機(jī)械剪切力刺激的結(jié)果。所以，孵化器和清潔空氣控制的細(xì)胞存活率差異不顯著。
結(jié)論與展望
? 第三代細(xì)胞暴露染毒系統(tǒng)cultex rfs compact，細(xì)胞氣液界面的直接暴露適用于6個(gè) 6.5 mm 或 12 mm 現(xiàn)有的通用細(xì)胞培養(yǎng)小室（costar®和 falcon®）的直接暴露。
? 每個(gè)cultex® rfs compact 內(nèi)可進(jìn)行兩組平行實(shí)驗(yàn)，三個(gè)培養(yǎng)小室（cell culture inserts）用于受試物，另外三個(gè)平行用于清潔空氣或不同濃度受試物。
? 數(shù)據(jù)顯示其具有良好的劑量效應(yīng)和高度的實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。
? 適用于氣體為載體的各種受試物質(zhì)，如香煙煙霧、納米顆粒、pm2.5、pm10、vocs、霧霾混合物、干粉顆粒物及霧化氣溶膠等等。