聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（pcr）是一種用于放大擴(kuò)增特定的dna 片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊dna復(fù)制，pcr的最大特點(diǎn)是能將微量的dna 大幅增加。我們進(jìn)行核酸擴(kuò)增時(shí)，經(jīng)常會不定的出現(xiàn)一些異常問題，那么遇到這些問題該怎么解決呢？接下來跟著遠(yuǎn)慕一起來看看前輩們的經(jīng)驗(yàn)。沒有ct值檢測結(jié)果遇到?jīng)]有ct 值情況,排查是否有以下問題: 1.循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45 循環(huán)，不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn)); 2.pcr 程序設(shè)置錯(cuò)誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般sg 法采用72 ℃延伸時(shí)采集，taqman 法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號，另外熒光采集是否選中。3.引物或探針降解?？赏ㄟ^page 電泳檢測引物和探針是否降解; 4.模板量可能降解或上樣量不足(不超過5 ng，根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解，應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況，建議將模板樣本小量分裝儲備，避免反復(fù)凍融; 5.引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子，以確保擴(kuò)增基因組dna；上下游引物tm 值超過4 ℃以上也會影響擴(kuò)增)。ct值過晚在相對定量中, ct 值一般控制在15 ~ 25 之間比較好，如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品，ct 值會增大, 但是一般不宜超過4 循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。. 因此，判斷ct 值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。1.擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化；引物或探針設(shè)計(jì)不合理，需要重新設(shè)計(jì)；2.pcr 程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度；退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長1s)；3.mgcl2 濃度不合適，增加鎂離子濃度等。pcr 各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足；4.pcr 產(chǎn)物太長。pcr 產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過5 bp；5.模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行pcr 檢測或?qū)⒛０暹M(jìn)行稀釋。陰性對照擴(kuò)增有信號陰性對照擴(kuò)增有信號排查各操作環(huán)節(jié)是否有不當(dāng),造成交叉污染:1.引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化。應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。2.引物濃度不佳。適當(dāng)降低引物濃度，并注意上下游引物的濃度配比。3.鎂離子濃度過高。適當(dāng)降低鎂離子濃度,或選擇更適合的mix 試劑盒。4.模板有基因組的污染。rna 提取過程中避免基因組dna 的引入,或通過引物設(shè)計(jì)避免非特異性擴(kuò)增。5.交叉污染。在所用的試劑中有交叉污染, 或操作環(huán)境中有氣溶膠造成污染, 建議對操作環(huán)境進(jìn)行處理, 或者更換新的環(huán)境、加樣器、槍頭以及所有的引物、試劑等。標(biāo)準(zhǔn)曲線不佳標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳r2 < .9，很有可能是以下環(huán)節(jié)存在問題:1.標(biāo)準(zhǔn)品稀釋或者加樣誤差,使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度。2.標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解。應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融,將高濃度dna 模板分裝,保存于-2 ℃或-8 ℃，現(xiàn)配現(xiàn)用。3.引物或探針不佳。重新設(shè)計(jì)更好更穩(wěn)定的引物或探針。4.模板中存在抑制物。模板濃度過高,根據(jù)現(xiàn)有商品化熒光定量試劑盒的要求，一般模板量以5 ~ 5 ng 為宜。熔解曲線峰不特異熔解曲線峰不特異很有可能是以下環(huán)節(jié)存在問題:1.引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化。應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)；引物濃度不佳, 尤其是涉及二聚體存在時(shí), 適當(dāng)降低引物濃度, 并注意上下游引物的濃度比例; 2.模板有基因組污染。rna 提取過程中避免基因組dna 的引入, 或通過引物設(shè)計(jì)避免非特異性擴(kuò)增。3.離子濃度不合適。適當(dāng)降低鎂離子濃度, 或選擇更適合的mix 試劑盒, 不同試劑盒在該方面的優(yōu)化能力不適合, 有些情況下可以通過更換試劑盒改善結(jié)果。擴(kuò)增曲線異常遇到擴(kuò)增曲線異常，比如s 型曲線等等情況,有可能是以下環(huán)節(jié)存在問題：1.模板的濃度太高或者降解。2.熒光染料的降解。3.人為污染。在操作熒光定量pcr 時(shí)，帶上新的一次性手套,蓋上避免任何指紋或者字跡等。4.液體揮發(fā)。耗材氣密性等問題引起液體蒸發(fā),沒有很好的聚集在管子里; 5.氣泡。操作問題如移液槍加樣引起的氣泡問題。擴(kuò)增效率低該情況適用于針對所有的基因,特別是內(nèi)參基因仍無法獲得較好的擴(kuò)增信號時(shí),應(yīng)考慮如下情況:1.反應(yīng)試劑中部分成分比例是否最佳，另外考慮熒光染料是否降解。2.反應(yīng)條件不夠優(yōu)化?？蛇m當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法,適當(dāng)延長變性退火時(shí)間。3.反應(yīng)體系中有pcr 反應(yīng)抑制物。一般是加入模板時(shí)所引入的,應(yīng)先把模板適度稀釋，再加入反應(yīng)體系，減少抑制物的影響。其他原因模板反復(fù)凍融、模板長時(shí)間在紫外光下照射導(dǎo)致的模板發(fā)生突變；基因序列與ncbi 上的不一致。今天的講解就到這里啦，關(guān)于pcr的這些小陷阱你了解了嗎？如果有其他實(shí)驗(yàn)相關(guān)的問題也可以咨詢我們遠(yuǎn)慕生物技術(shù)人員哦~