用于快速檢測(cè)的表面等離子共振儀器——p4spr是一款非常便利與研究人員快速開(kāi)發(fā)生物測(cè)定方法和進(jìn)行生物分子相互作用特征分析的日常工具。
下面簡(jiǎn)單介紹一下p4spr的常見(jiàn)應(yīng)用以及在應(yīng)用上的優(yōu)勢(shì)。
一 dna-蛋白檢測(cè)——基因調(diào)控-lac操縱子/lac阻遏物
乳糖操縱子（laco）是參與乳糖分解的一個(gè)基因群，調(diào)控乳糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)，乳糖阻遏物（laci）作為一種dna-結(jié)合蛋白，是控制乳糖操縱子的關(guān)鍵。
利用p4spr可以測(cè)定laco/laci體系的結(jié)合強(qiáng)度（親和力，kd），其儀器使用簡(jiǎn)單，操作界面友好，非常適合實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員開(kāi)發(fā)和本科課程教學(xué)。
圖 1 spr信號(hào)在不同濃度laco下隨時(shí)間的變化
圖 2 增加laci濃度時(shí)的疊加結(jié)合曲線
p4spr成功地表征了lac操縱子dna及其抑制蛋白的結(jié)合相互作用，該系統(tǒng)也可以作為表征其他生物系統(tǒng)的有用工具，比如dna-dna、dna-rna和適配體等。
p4spr的優(yōu)勢(shì)還體現(xiàn)在它具有的模塊化、可移動(dòng)性和多通道設(shè)計(jì)，用于藥物發(fā)現(xiàn)、生物/傳感和系統(tǒng)集成應(yīng)用。并且?guī)缀醪恍枰獦悠分苽?，可以快速和?jiǎn)單的進(jìn)行系統(tǒng)設(shè)置，同時(shí)還可以節(jié)省用戶的試劑成本。
二 小分子檢測(cè)——在環(huán)境水域中進(jìn)行rdx的現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試
環(huán)三亞甲基三硝銨（rdx）廣泛用于制造，也是爆炸污染的主要成分。
目前，對(duì)于rdx的檢測(cè)通常采用實(shí)驗(yàn)室的hplc-uv檢測(cè)法，雖然這種方法十分靈敏，但是因?yàn)樗枰跍y(cè)試之前進(jìn)行取樣、運(yùn)輸、儲(chǔ)存和樣品準(zhǔn)備等工作，因此耗時(shí)較長(zhǎng)，需要幾天甚至幾周的時(shí)間。而利用p4spr的便攜性可以直接到現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)rdx，儀器只需要進(jìn)行簡(jiǎn)單的現(xiàn)場(chǎng)布置就能使用，并且能夠直接檢測(cè)，不需要樣品制備，檢測(cè)時(shí)間通常只需要幾個(gè)小時(shí)。
圖 3 用于rdx檢測(cè)的傳感器校準(zhǔn)的spr傳感器圖
圖 4 spr響應(yīng)與10 nm標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行歸一化
圖 5 rdx在不同溫度下對(duì)10 nm下spr響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化校準(zhǔn)曲線
p4spr為rdx的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了的分析能力。它的便攜性和穩(wěn)定性使其適用于各種環(huán)境條件下的現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試，因此還可以廣泛適用于其他污染物的檢測(cè)。
三 蛋白質(zhì)-小分子相互作用——跨膜蛋白（tm）的作用機(jī)制
cd36是具有多種功能的跨膜蛋白的一部分，它在脂質(zhì)攝取、細(xì)胞粘附和病原體感知方面有多種作用。配體/cd36蛋白的相互作用可能介導(dǎo)生物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。p4spr具有無(wú)標(biāo)簽傳感和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的特點(diǎn)，這在研究生物分子相互作用以闡明通路方面表現(xiàn)出了明顯的優(yōu)勢(shì)。
圖 6 評(píng)估與cd36傳感器芯片的小分子相互作用的spr方法的示意圖
圖 7 指示化合物的kd和spr信號(hào)（δλspr,max）
p4spr為了解跨膜蛋白與信息素刺激的作用機(jī)制提供了幫助，并且模塊化設(shè)計(jì)提供了微流控系統(tǒng)，多通道特性提高了結(jié)果的精度，高靈敏度也允許檢測(cè)低分子量的小分子物質(zhì)，加上友好的操作界面，p4spr非常適用于快速獲取實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)來(lái)表征分子間結(jié)合的相互作用。
四 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用
急性淋巴母細(xì)胞白血?。╝ll）是一種疾病，大腸桿菌l-天冬酰胺酶（ecaii）作為一種生物治療藥物是被證明對(duì)all有效的主要藥物之一。而患者可以通過(guò)產(chǎn)生抗體來(lái)中和ecaii，從而降低治療效率。通過(guò)p4spr可以有效檢測(cè)抗體并且p4spr具有可重復(fù)的傳感器效率這一特點(diǎn)。
圖 8 ecaii受體的固定化和免疫傳感性能綜述
圖 9 ecaii變體的固定化。在注射40 μg蛋白（0.1mgml?1）的腎折疊酶（黑色）或his標(biāo)記的ecaii：n21-ecaii（綠色）、n26-ecaii（藍(lán)色）和c8-ecaii（紅色）后，觀察ecaii變體表面固定的spr傳感器圖
p4spr操作的簡(jiǎn)易性可以讓實(shí)驗(yàn)者快速評(píng)估分析參數(shù)，比如固定化方法對(duì)受體表面覆蓋的影響以及傳感效率。它的多通道性也提高了結(jié)果的精度，而且具有高靈敏度，非常有利于生物樣本中的生物治療藥物的分析。與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（elisa）技術(shù)相比，p4spr無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記預(yù)處理，并且使用試劑的量更少，制備步驟更簡(jiǎn)潔，可以減少檢測(cè)的時(shí)間和試劑的成本。
五 抗體的快速質(zhì)量檢控
在進(jìn)行抗體的質(zhì)量檢控時(shí)，傳統(tǒng)的elisa通常只能進(jìn)行終點(diǎn)分析，而不能提供動(dòng)力學(xué)和親和力數(shù)據(jù)，表面等離子共振（spr）技術(shù)可以實(shí)時(shí)評(píng)估蛋白質(zhì)的相互作用并且不需要太多的樣品制備。
p4spr作為一種便攜式的spr設(shè)備可以讓科學(xué)家更加快速并且容易地獲得有價(jià)值的動(dòng)力學(xué)和親和力數(shù)據(jù)以驗(yàn)證質(zhì)量，而不影響靈敏度和結(jié)合特異性。例如應(yīng)用p4spr可以輕松確定哪種抗體與sars-cov-2核衣殼重組蛋白具有結(jié)合性能。
圖 10 固定化sars-cov-2核衣殼蛋白檢測(cè)抗核衣殼抗體的方案
圖 11 次和第二次注射，同時(shí)從每個(gè)通道（綠色、紅色、黑色）收集傳感器圖。參考通道為藍(lán)色
圖 12 所有3個(gè)通道（洋紅色）的平均傳感器圖，參考通道為藍(lán)色，每個(gè)傳感器圖代表了抗核衣殼抗體的不同來(lái)源
由于其檢測(cè)的高精度和靈敏性，所以無(wú)論檢測(cè)的蛋白是新的還是儲(chǔ)存了一段時(shí)間，p4spr都可以很好的區(qū)分其高活性和低活性，并且不需要太多的抗體樣品制備，可以直接注射到儀器中，能快速確定哪個(gè)抗體源應(yīng)該用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。因此，p4spr也為其他類型的生物制藥產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制提供了一個(gè)快速和簡(jiǎn)單的替代方案。
六 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的快速篩選
蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（ppis）幾乎是幾乎每一個(gè)生物過(guò)程的核心。在當(dāng)對(duì)自身免疫性疾病多發(fā)性硬化癥進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析時(shí)，就發(fā)現(xiàn)了幾十種相互作用。
而繪制生物體的相互作用圖譜是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。目前常用的高通量技術(shù)來(lái)繪制圖譜很費(fèi)力并且容易產(chǎn)生假陽(yáng)性。spr技術(shù)可以很好的彌補(bǔ)這一不足。
例如腸桿菌素是一種小分子鐵螯合劑，其生物合成途徑由6種蛋白質(zhì)enta-f組成。由于已經(jīng)確定entb和ente在這一生物合成途徑中相互作用，因此很可能有其他的ppis發(fā)生。p4spr可用于篩選參與大腸桿菌中腸桿菌素生物合成的ppis。
圖 13 傳感器圖顯示了固定化蛋白質(zhì)和注射的配體之間發(fā)生蛋白質(zhì)相互作用（紅色和白色），或沒(méi)有相互作用（綠色和藍(lán)色）
p4spr還可以進(jìn)行更多的ppi篩選，快速、準(zhǔn)確的ppi篩選能力非常有助于治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和藥物開(kāi)發(fā)。
七 片段化合物與蛋白質(zhì)相互作用——藥物發(fā)現(xiàn)
基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)已被確定為一種識(shí)別小化合物的策略，可進(jìn)一步發(fā)展為先導(dǎo)物和臨床候選物。平衡解離常數(shù)（kd）表明了一個(gè)片段（或配體）與在靶標(biāo)疾病中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力的程度，是一重要檢測(cè)參數(shù)。
傳統(tǒng)的微量熱泳動(dòng)技術(shù)（mst）、核磁共振技術(shù)（nmr）和等溫滴定量熱法（itc）經(jīng)常用于驗(yàn)證潛在的片段篩選。但是mst需要熒光標(biāo)記，而疏水熒光團(tuán)可能通過(guò)非特異性結(jié)合干擾配體-蛋白質(zhì)的相互作用；itc的通量相對(duì)較低，需要大量的樣本，而且運(yùn)行每個(gè)樣本可能需要幾個(gè)小時(shí)；nmr是一種無(wú)標(biāo)簽的方法，但只適合于評(píng)估較弱的粘合劑（mm到µm范圍）。
表面等離子體共振（spr）作為輔助片段篩選驗(yàn)證的新技術(shù)。雖然spr需要目標(biāo)蛋白的固定化步驟，但它使用了低數(shù)量的樣本?？梢钥焖賹?shí)時(shí)確定配體-蛋白復(fù)合物的親和信息。p4spr可以在不到2小時(shí)內(nèi)提供準(zhǔn)確的結(jié)果。
圖 14 在p4spr中測(cè)定片段和固定在傳感器芯片上的his標(biāo)記蛋白之間的kd
圖 15 傳感器圖顯示了配體在40µm時(shí)與兩個(gè)通道中固定化蛋白的實(shí)時(shí)結(jié)合數(shù)據(jù)（紅色和白色曲線）
圖 16 通過(guò)繪制ru與µm中濃度的spr變化來(lái)測(cè)定kd
p4spr能夠快速評(píng)估片段和蛋白質(zhì)之間的kd。通過(guò)4個(gè)微流控通道，一次最多注射4個(gè)重復(fù)樣品可以獲得準(zhǔn)確的kd。相同濃度的樣品可以在相同的傳感器芯片上進(jìn)行注射，從而降低消耗品成本。最重要的是，這些數(shù)據(jù)顯示了在自己的研究實(shí)驗(yàn)室中，省去了預(yù)定的步驟，并且連接到我們的knx2模塊可以測(cè)定kon和koff以提供動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，這是藥物設(shè)計(jì)的重要參數(shù)。因此，p4spr非常有助于藥物發(fā)現(xiàn)。
八 疫苗監(jiān)測(cè)——血凝素檢測(cè)
血凝素（ha）的含量是流感疫苗監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)。目前評(píng)估疫苗批次的黃金標(biāo)準(zhǔn)方法是單徑向免疫擴(kuò)散（srid）試驗(yàn)。雖然這一方法從1978年就開(kāi)始使用，不過(guò)仍存在一定的局限性，首先它是一種離線的方法，需要將樣品從流水線取下進(jìn)行單獨(dú)分析，其次，srid所需的參考血清和抗原試劑可能需要6個(gè)月的準(zhǔn)備，導(dǎo)致向公眾發(fā)布疫苗批次的時(shí)間大大延遲，同時(shí)，srid存在低精度和低通量的不足，并且一次檢測(cè)大約需要22小時(shí)。
spr是一種更快速準(zhǔn)確的評(píng)估流感和其他疫苗效力的方法。
圖 17 在a、b和c通道的三次ha滴定注射以及控制通道d（藍(lán)色）的傳感器圖
圖 18 ha與抗ha抗體結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)曲線
p4spr可以通過(guò)固定抗ha抗體到芯片上，并使用標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)檢測(cè)樣品中ha的數(shù)量。每個(gè)樣品只需10分鐘即可獲得數(shù)據(jù)。在疫苗生產(chǎn)過(guò)程中，安裝一個(gè)在線spr儀器來(lái)實(shí)時(shí)評(píng)估疫苗批次將是有利的。