ce-sds純度檢測(cè)試盒產(chǎn)品介紹
產(chǎn)品信息
蛋白質(zhì)的分子大小變異體檢測(cè)是蛋白質(zhì)生產(chǎn)過(guò)程中至關(guān)重要的檢測(cè)指標(biāo),ce-sds法檢測(cè)廣泛應(yīng)用在包括單抗在內(nèi)的各種蛋白質(zhì)純度檢測(cè)中。ce-sds純度檢測(cè)試劑盒是經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的靈敏度、準(zhǔn)確度、性價(jià)比、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)更高的國(guó)產(chǎn)化新型檢測(cè)試劑盒試劑盒中包含優(yōu)化的sds樣品緩沖液a(ph=9.0)sds樣品緩沖液b(ph=6.5)[1]涂層毛細(xì)管、優(yōu)化的凝膠緩沖液(保密配方)、內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)品、酸堿沖洗液等試劑及耗材。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證,試劑盒可廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)還原及非還原ce-sds純度檢測(cè),并且可在市面上常見毛細(xì)管電泳系統(tǒng)中使用。
[試劑盒成分信息]試劑盒儲(chǔ)存條件
注意:
凝膠緩沖液或者sds樣品緩沖液在使用之前,若注意到試劑瓶底部有沉淀,需室溫?cái)嚢杌蛘叱暡ǔ曋敝猎噭┢恐芯彌_液溶解后方可使用。在吸取緩沖液進(jìn)毛細(xì)管電泳系統(tǒng)進(jìn)樣之前,緩沖液需保證在室溫中放置至少4小時(shí)。
2.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品信息
蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品包含14.3,29.0,44.2,55.0,6.4,105及150kd的蛋白質(zhì),用ce-mw蛋白質(zhì)分子量測(cè)定實(shí)驗(yàn),該產(chǎn)品不包括在試劑盒中,需單獨(dú)采購(gòu)。
3.內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)品信息
14.3kda的蛋白質(zhì)作為遷移標(biāo)記物,用于蛋白樣品相對(duì)于內(nèi)標(biāo)的相對(duì)遷移來(lái)計(jì)算分子量,可獲得更準(zhǔn)確的分子量結(jié)果和鑒定信息。另外,內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)品可作為常規(guī)蛋白純度檢測(cè)內(nèi)標(biāo),用于校準(zhǔn)出峰時(shí)間。
[樣品處理]
1.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品制備
(1)非還原模式
用樣品緩沖液溶解稀釋蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品,使蛋白的終濃度0.2-2mg/ml之間,總體積95ul。加入5uln-乙基馬來(lái)酷亞胺(nem)溶液。蓋好瓶蓋,用封口膜封好,并充分混勻，離心機(jī)6000rpm離心至少1分鐘。70°c水浴10分鐘。室溫冷卻至少3分鐘,離心機(jī)6000rpm離心至少1分鐘。轉(zhuǎn)移95ul制備好的樣品至內(nèi)插管中,內(nèi)插管放入進(jìn)樣瓶中,蓋好進(jìn)樣瓶蓋子。
(2)還原模式
用樣品緩沖液溶解稀釋蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品,使蛋白的終濃度在0.2-2.0mg/ml之間,總體積為95ul。加入5ul2-琉基乙醇,蓋上瓶蓋,用封口膜封好,并充分混勻,離心6000rpm離心至少1分鐘。70°c水浴10分鐘。室溫冷卻至少3分鐘,離心機(jī)6000rpm離心至少1分鐘。轉(zhuǎn)移95ul制備好的樣品至內(nèi)插管中,內(nèi)插管放入進(jìn)樣瓶中,蓋好進(jìn)樣瓶蓋子。
2.蛋白樣品預(yù)處理
蛋白樣品的脫鹽:信號(hào)強(qiáng)度和分離度對(duì)于蛋白中鹽的濃度十分敏感,如果蛋白樣品濃度低于10mg/ml并且緩沖液鹽的終濃度高于50mm,樣品的進(jìn)樣效率就會(huì)降低以下是使用超濾法對(duì)樣品的脫鹽步驟。
向超濾離心管中加入1ml蛋白樣品,再加入1mlsds樣品緩沖液。7000g離心20min。再加入2 ml樣品緩沖液,7000 g離心20 min。上下顛倒超濾離心管使上層溶濃在濾膜作用下濾到新的小瓶中,并在5000g下離心3min。將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到樣品管中,加入樣品緩沖液使終量為1ml。
3.蛋白樣品的濃度
保證在加入sds樣品緩沖液后,蛋白的濃度在0.2-2.0mg/ml之間,推薦最佳蛋白濃度為1mg/ml。如果蛋白濃度過(guò)高,與蛋白結(jié)合的sds就會(huì)不足,導(dǎo)致峰變寬而且分辨率降低;如果蛋白濃度過(guò)低,信號(hào)就會(huì)相應(yīng)變低。
4.非還原樣品處理
對(duì)比一個(gè)蛋白的還原和非還原狀態(tài)可以得到一些結(jié)構(gòu)信息，通過(guò)烷基化蛋白樣品口以減少由于蛋白自動(dòng)還原產(chǎn)生的蛋白異質(zhì)性。以下是配制非還原蛋白樣品的過(guò)程
(1) 烷基化試劑的制備
使用100mm n-乙基馬來(lái)酷亞胺(nem)或800 mm碘酷胺(am)作為烷基化試劑[2]3.加入蛋白質(zhì)和分析樣品中后分別稀釋20倍至終濃度5 mm或40 mm。
a)稱取12.5mgnem或148mglam置于1.5ml離心管中。
b)加入1000ul超純水,蓋好瓶蓋并充分混合并標(biāo)記。2-8°c避光保存,有效期5天
(2)樣品的制備
用樣品緩沖液溶解稀釋樣品,使蛋白的終濃度0.2-2mg/ml之間,總體積95ul。加入2ul的內(nèi)標(biāo)。加入5uln-乙基馬來(lái)酷亞胺(nem)溶液。蓋好瓶蓋,用封口膜封好,并充分混勻,離心機(jī)6000rpm離心至少1分鐘。70°c水浴10分鐘。室溫冷卻至少3分鐘,離心機(jī)6000rpm離心至少1分鐘。轉(zhuǎn)移95ul制備好的樣品至內(nèi)插管中,內(nèi)插管放入進(jìn)樣瓶中,蓋好進(jìn)樣瓶蓋子。
5.還原樣品處理
用樣品緩沖液溶解稀釋樣品,使蛋白的終濃度在0.2-2.0mg/ml之間,總體積為95ul加入2ul的內(nèi)標(biāo)。加入5ul2-琉基乙醇,蓋上瓶蓋,用封口膜封好,并充分混勻,離心機(jī)6000rpm離心至少1分鐘。70°c水浴10分鐘。室溫冷卻至少3分鐘,離心機(jī)6000rpm離心至少1分鐘。轉(zhuǎn)移95ul制備好的樣品至內(nèi)插管中,內(nèi)插管放入進(jìn)樣瓶中,蓋好進(jìn)樣瓶蓋子。