4-香豆酸：輔酶a連接酶（4cl）活性檢測(cè)試劑盒
（紫外分光光度法）
注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
產(chǎn)品貨號(hào)：ba1005
產(chǎn)品規(guī)格：50管/48樣
產(chǎn)品內(nèi)容：
提取液：液體60ml×1瓶，4℃保存；
試劑一：液體30ml×1瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入6ml蒸餾水溶解，可以分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融。
試劑三：液體6ml×1瓶，4℃保存；
試劑四：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前用6ml蒸餾水溶解備用，可以分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融。
試劑五：粉劑×1支，4℃保存；加入1ml蒸餾水溶解。臨用前用蒸餾水稀釋40倍后備用，現(xiàn)用現(xiàn)配。
產(chǎn)品說明：
4-香豆酸：輔酶a連接酶（4-coumarate:coa ligase，4cl）是木質(zhì)素生物合成的關(guān)鍵酶之一，主要催化肉桂酸及其羥基或者甲氧基衍生物生成相應(yīng)的輔酶a酯，這些中間產(chǎn)物隨后進(jìn)入苯丙類衍生物支路合成途徑。該酶主要存在于高等植物、酵母和菌類中，研究該酶可以探討多種生物細(xì)胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機(jī)理，為減少水果石細(xì)胞含量而提高其品質(zhì)提供依據(jù)。
4cl催化4-香豆酸和 coa生成4-香豆酸coa，其在333nm 下測(cè)有特征吸收峰，測(cè)定4-香豆酸coa的生成速率，即可反映4cl活性。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)、低溫臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、1ml石英比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、ep管、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、粗酶液提取：
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（ml）為500~1000：1 的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1ml提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或200w，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
二、測(cè)定步驟：
1、紫外分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至333nm，蒸餾水調(diào)零。
2、工作液的配制：按體積比將試劑二：試劑三：試劑四：試劑五=1:1:1:1的比例配制工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。
3、操作表：在1.5mlep管中進(jìn)行下列操作：
試劑名稱（µl）
空白管
測(cè)定管
工作液
100
樣本
100
蒸餾水
400
400
試劑一
500
500
充分混勻后測(cè)定333nm下的初始值a1，37℃反應(yīng)30min后再次測(cè)定吸光值a2，計(jì)算△a測(cè)定管=a2 測(cè)定管-a1測(cè)定管，△a空白管= a2空白管-a1空白管，△a=△a測(cè)定管-△a空白管。
4cl 活性計(jì)算：
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol 4-香豆酸輔酶a定義為一個(gè)酶活力單位。
4cl（u/mg prot）＝[?a×v反總÷（ε×d）×109]÷(v樣×cpr) ÷t=15.87×?a÷cpr。
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位定義：每g組織每分鐘生成1 nmol 4-香豆酸輔酶a定義為一個(gè)酶活力單位。
4cl（u/g 鮮重）＝[?a×v反總÷（ε×d）×109]÷(w ×v樣÷v樣總) ÷t=15.87×?a÷w。
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1 nmol 4-香豆酸輔酶a定義為一個(gè)酶活力單位。
4cl（u/104 cell）＝[?a×v反總÷（ε×d）×109]÷(500×v樣÷v樣總) ÷t=0.03174×?a。
v反總：反應(yīng)體系總體積，1×10-3l；ε：4-香豆酸輔酶a摩爾消光系數(shù)，2.1×104l/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；v樣：加入樣本體積，0.1ml；v樣總：加入提取液體積，1ml；t：反應(yīng)時(shí)間，30min；cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；w：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。
注意事項(xiàng)：
1、若?a大于0.5，將粗酶液用蒸餾水稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。
2、建議一次測(cè)定不要測(cè)定過多樣品以免耽誤過多的酶促反應(yīng)時(shí)間。
3、空白管為檢測(cè)各試劑組分質(zhì)量的檢測(cè)孔，正常情況下，變化不超過0.01。