中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)
sn/t 5220-2019
出口食品中3-氯丙醇酯及縮水甘油酯的測定氣相色譜-質(zhì)譜法
determination of 3-chloropropanol esters（3-mcpde）and glycidol
esters（ge）in food products for export-gas chromatography mass
spectrometry method
1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了出口食品中3-氯丙醇酯和縮水甘油酯氣相色譜-質(zhì)譜測定方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于食用油、奶粉、油炸膨化食品及焙烤類食品中3-氯丙醇酯和縮水甘油酯的定性檢測和定量檢測。
2 規(guī)范性引用文件
下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
gb/t 6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法。
3 方法原理
本標(biāo)準(zhǔn)通過水解反應(yīng)將食品中存在的各種3-氯丙醇酯（3-mcpde）和縮水甘油酯（ge）全部轉(zhuǎn)化為3-氯丙醇（3-mcpd），經(jīng)苯基硼酸（pba）衍生化后，用氣相色譜-質(zhì)譜法測定其含量，并以其表示3-mcpde的總量。
方法通過在水解反應(yīng)終點(diǎn)分別加入氯化鈉-冰乙酸溶液（含氯的終止反應(yīng)液，提供氯元素，使縮水甘油完全轉(zhuǎn)化為3-mcpd）和硫酸鈉-冰乙酸溶液（不含氯的終止反應(yīng)液，無法使縮水甘油轉(zhuǎn)化為3-mcpd）進(jìn)行對照試驗(yàn)，衍生化后分別測得3-mcpde與ge的總量和3-mcpde的實(shí)際含量，利用差減法從而得到ge的含量。
4 試劑和材料
除另有說明外，所用試劑均為分析純。水采用gb/t 6682規(guī)定的一級水。
4.1 甲醇：色譜純。
4.2 冰乙酸：色譜純。
4.3 甲醇鈉。
4.4 無水硫酸鈉。
4.5 氯化鈉。
4.6 丙酮：色譜純。
4.7 苯基硼酸。
4.8 叔丁基甲醚：色譜純。
4.9 乙酸乙酯：色譜純。
4.10 正己烷：色譜純。
4.11 異辛烷：色譜純。
4.12 0.5 mol/l甲醇鈉-甲醇溶液：稱取固體甲醇鈉（4.3）2.701g于100 ml容量瓶中，以甲醇（4.1）定容至100 ml，混勻。
4.13 10%硫酸鈉-乙酸溶液：稱取無水硫酸鈉固體（4.4）10 g，溶于100 ml水中，再向溶液中加入4 ml冰乙酸（4.2）。
4.14 20%氯化鈉-乙酸溶液：稱取氯化鈉固體（4.5）20 g，溶于100 ml水中，再向溶液中加入4 ml冰乙酸（4.2）。
4.15 丙酮-水溶液（19:1，v/v）：量取190 ml丙酮（4.6）和10 ml水，混勻。
4.16 苯基硼酸（pba）溶液：稱取2.5 g苯基硼酸（4.7）溶于20 ml丙酮-水（19:1，v/v）（4.15），混勻。
4.17 叔丁基甲醚-乙酸乙酯溶液（8:2，v/v）：量取80 ml叔丁基甲醚（4.8）和20 ml乙酸乙酯（4.9），混勻。
4.18 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：棕櫚酸-3-氯丙二醇酯（3-mcpde-palimtate，cas號51930-97-3，分子量587.36），和棕櫚酸縮水甘油酯（glycidyl palmitate，cas號7501-44-2，分子量312.49），純度均大于98％。
4.19 內(nèi)標(biāo)物：棕櫚酸-d5-3-氯丙二醇酯（d5-3-mcpde-palimtate，cas號1185057-55-9，分子量592.39），純度大于98％。
4.20 標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別準(zhǔn)確稱取25.0 mg的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（精確到0.001g），用叔丁基甲醚-乙酸乙酯溶液（4.17）溶解后定容至50.0 ml刻度，配制成濃度為500 mg/l的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于0℃~ 4℃冰箱內(nèi)儲存，有效期12個月。
4.21 混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：分別準(zhǔn)確吸取10.6 ml棕櫚酸-3-氯丙二醇酯，5.65 ml棕櫚酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)儲備液（4.20）于50 ml容量瓶中，用叔丁基甲醚-乙酸乙酯溶液（4.17）定容至刻度，配制成濃度為20.0 mg/l（以3-氯丙醇計）的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于0℃~ 4℃冰箱內(nèi)儲存，有效期6個月。
4.22 內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱取1.00 mg的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)（精確到0.001g），用叔丁基甲醚-乙酸乙酯溶液（4.17）溶解后定容至50.0 ml刻度，配制成濃度為20.0 mg/l的內(nèi)標(biāo)溶液，于0℃~ 4℃冰箱內(nèi)儲存，有效期12個月。
4.23 微孔濾膜：0.22μm，有機(jī)相型。
5 儀器和設(shè)備
5.1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gc-ms），配電子轟擊源（ei源）。
5.2 渦旋混合器。
5.3 超聲波水浴。
5.4 冷凍離心機(jī)：15℃，10 000 r/min。
5.4 氮吹濃縮儀。
5.5 水浴恒溫振蕩器。
5.6 分析天平：感量0.001 g。
6 測定步驟
6.1 樣品制備
6.1.1 提取
6.1.1.1 奶粉樣品
稱取2 g（精確至0.001 g）試樣于50 ml具塞聚四氟乙烯離心管中（每個樣品需要兩份作對照），加入2.0 ml去離子水，準(zhǔn)確加入50μl的20.0 mg/l內(nèi)標(biāo)溶液（4.22），再加入5 ml正己烷（4.10），超聲提取15 min，以不低于10 000 r/min，離心10 min。取出后，移取上清液于新的50 ml離心管中，重復(fù)提取1次~2次，合并提取液。置于氮吹濃縮儀中，于40℃-50℃下用氮?dú)獯抵撂崛∫菏Ｓ? ml作為待反應(yīng)液。
6.1.1.2 油炸膨化類食品樣品
稱取顆粒或粉末狀試樣2 g（精確至0.001 g）于50 ml具塞聚四氟乙烯離心管中（每個樣品需要兩份作對照），加入2.0 ml去離子水，準(zhǔn)確加入50μl的20.0 mg/l內(nèi)標(biāo)物溶液（4.22），再加入5ml正己烷（4.10），超聲提取15 min，以不低于10 000 r/min，離心10 min。取出后，移取上清液于新的50 ml離心管中，重復(fù)提取1次~2次，合并提取液。置于氮吹濃縮儀中，于40℃~50℃下用氮?dú)獯抵撂崛∫菏Ｓ? ml作為待反應(yīng)液。
6.1.1.3 食用油樣品
稱取0.5 g（精確至0.001 g）油樣品于15 ml具塞聚四氟乙烯離心管中（每個樣品需要兩份作對照），準(zhǔn)確加入50μl的20.0 mg/l內(nèi)標(biāo)物溶液（4.22），再加入2 ml叔丁基甲醚-乙酸乙酯溶液（4.17），將離心管置于超聲波清洗器于45℃下，超聲混合提取15 min，作為待反應(yīng)液。
6.1.1.4 焙烤類食品樣品
稱取顆粒狀試樣2 g（精確至0.001 g）于50 ml具塞聚四氟乙烯離心管中（每個樣品需要兩份作對照），加入2.0 ml去離子水，準(zhǔn)確加入50μl的20.0 mg/l內(nèi)標(biāo)物溶液（4.22），再加入5 ml正己烷（4.10），超聲提取15 min，以不低于10 000 r/min，離心10 min。取出后，移取上清液于新的50ml離心管中，重復(fù)提取1次~2次，合并提取液。置于氮吹濃縮儀中，于40℃~50℃下用氮?dú)獯抵撂崛∫菏Ｓ? ml作為待反應(yīng)液。
6.1.2 水解反應(yīng)
在6.1的待反應(yīng)液中加入1 ml叔丁基甲醚-乙酸乙酯溶液（食用油無需加入該溶液），再向離心管中加入0.5 ml甲醇鈉-甲醇溶液（4.12）進(jìn)行水解反應(yīng)，嚴(yán)格控制反應(yīng)時間，7 min后，向每一組對照樣品中分別加入3 ml 10%硫酸鈉-乙酸溶液（4.13）、3 ml 20%氯化鈉-乙酸溶液（4.14），充分振蕩，使水解反應(yīng)及時終止。再加入3 ml正己烷進(jìn)行脫脂，充分混勻后靜置，待水相有機(jī)相分層明顯后，吸取上層棄去，脫脂操作進(jìn)行兩遍。
6.1.3 衍生化反應(yīng)
脫脂后，向各離心管中加入0.2 ml pba溶液（4.16），振蕩混勻后，置于水浴恒溫振蕩器中，于70℃環(huán)境衍生反應(yīng)20 min。衍生后，離心管冷卻至室溫，加入5 ml乙酸乙酯渦旋提取兩遍，合并兩次提取液于40℃下用氮?dú)獯蹈?，殘留物?.00 ml異辛烷（4.11）定容，充分渦旋混合過有機(jī)膜后，濾液作為待測樣液供gc-ms分析。
6.2 測定
6.2.1 測定條件
氣相色譜-質(zhì)譜測定的參考條件如下：
a）離子源：電子轟擊源（ei源）
b）色譜柱：db-5ms毛細(xì)管柱（30.0 m×0.25 mm×0.25μm），或相當(dāng)者；
c）程序升溫：60℃保持1min，以5℃/min的速率升溫至180℃，再以30℃/min的速率升溫至280℃，保持2min；
d）進(jìn)樣口溫度：280℃；
e）gc-ms接口溫度：280℃；
f）進(jìn)樣量：1μl；
g）監(jiān)測方式：選擇離子掃描模式（sim模式）；
3-mcpd-dba：m/z196、147*、91
d5-3-mcpd-dba：m/z 201、150*、93
h）溶劑延遲：4min。
6.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜測定
按照上述測定條件，分別對混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品試液進(jìn)行檢測，以保留時間和離子豐度比對樣品進(jìn)行定性，標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法對樣品進(jìn)行定量。3-mcpd-pba的參考保留時間為19.344 min，d5-3-mcpd-pba的參考保留時間為19.289 min。典型的色譜圖參見附錄a中的圖a.1。3-mcpde衍生物和d5-3-mcpde衍生物典型的質(zhì)譜圖分別見附錄a中的圖a.2和圖a.3。
6.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
用適量體積的叔丁基甲醚-乙酸乙酯溶液（4.17）將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（4.21）稀釋（每個標(biāo)準(zhǔn)品需要兩份作對照），配置成濃度分別為0.0200 mg/l、0.200 mg/l、0.500 mg/l、1.00mg/l、2.00 mg/l的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，經(jīng)過6.1.2和6.1.3的處理步驟后，得到3-mcpde測定曲線和3-mcpde、ge總量測定曲線。按照6.2的測定條件濃度由低到高進(jìn)樣測定，以目標(biāo)物定量離子峰面積/內(nèi)標(biāo)物定量離子峰面積-目標(biāo)物濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程，參見附錄b。
7 結(jié)果計算和表述
7.1 3-mcpde的含量
試樣中3-mcpde的含量（以3-mcpd計）由色譜數(shù)據(jù)處理軟件或按式（1）計算獲得。
式中：
x1——試樣中3-mcpde的含量，單位為微克每千克（µg/kg）；
*為定量離子
c1——從標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的試樣溶液中3-mcpde的含量，單位為毫克每升（mg/l）；
v——試樣最終的定容體積，單位為毫升（ml）；
m——試樣的稱樣質(zhì)量，單位為克（g）。
計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。
7.2 ge的含量
試樣中g(shù)e的含量（以3-mcpd計）由色譜數(shù)據(jù)處理軟件或按式（2）計算獲得。
式中：
x 2——試樣中g(shù)e的含量，單位為微克每千克（µg/kg）；
c——從標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的試樣溶液中3-mcpde和ge的總含量，單位為毫克每升（mg/l）；
v——試樣最終的定容體積，單位為毫升（ml）；
m——試樣的取樣質(zhì)量，單位為克（g）；
x1——試樣中3-mcpde的含量，單位為微克每千克（µg/kg）；
計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。
8 定量限
本標(biāo)準(zhǔn)的定量限：奶粉樣品的定量限為25.0μg/kg；油炸膨化類食品樣品的定量限為125μg/kg；食用油樣品的定量限為100μg/kg；焙烤類食品樣品的定量限為20.0μg/kg。
9 回收率和精密度
奶粉樣品（嬰幼兒奶粉）、油炸膨化類食品樣品（薯片）、食用油樣品（橄欖油、大豆油）和焙烤類食品樣品（蛋糕、面包和曲奇），分別在三個添加濃度范圍內(nèi)的回收率和精密度數(shù)據(jù)參見附錄b。