免疫pcr試驗方法（一）材料與方法
1.*標記特異性抗體的制備免疫球蛋白(如igg、igm)的fc片段上有糖基存在，因而可用能與糖基結(jié)合的biotin-hydrazide作*標記。
(1) 將純化的抗體(igm或igg， 0.1~1.0ml)在標記緩沖液(0.1mol/l naac，ph值5.5， 0.1mol/l nacl)中4℃透析放置一晚。
(2)吸取0.5ml至微量離心管中，加過酸鈉溶液至終濃度為10mmol/l，置冰浴上于暗處孵育30min，使抗體分子上的糖基氧化。
(3)將氧化的抗體過pbs平衡的sephadex g25 pd-10預裝柱，使之與過酸鈉分開。收集蛋白峰。
(4)向抗體管中加入biotin-lc-hydrazide(pierce)至終濃度5mmol/l，置混搖器上室溫孵育1h。
(5)用含0.02%nan3的pbs平衡sephadex g25預裝柱，將*標記的抗體分子過柱與游離的*分開。收集蛋白峰，保存-20℃。
2.*標記dna片段的制備作為將與抗體偶聯(lián)的報告dna片段，應確保在待測抗原來源的機體dna中無同源序列，如可選用大腸桿菌的序列作為報告dna去檢測人源的標本。dna片段大小為300~500bp，*標記可采用pcr方法，根據(jù)報告dna的核苷酸序列合成一對引物，其中一個引物的5’端堿基上帶有*標記。
在0.5mlpcr管中按表將下列試劑混合。
表pcr系統(tǒng)組成
試 劑
添加量
終濃度
10×pcr緩沖液
10.0ul
1×
2.5mm 4dntp混合物
8.0ul
0.2mm
50um*標記的上游引物
1.0ul
0.5um
50um*標記的下游引物
1.0ul
0.5um
15mm模板dna
1.0ul
1.0ug
taq dna聚合酶
1.0ul
5u
加水至 100ul
混勻后上面覆蓋液體石蠟。
95℃加熱5min，然后在pcr儀上按下列程序擴增：94℃ 1min;55℃ 1min;72℃ 1min; 40個循環(huán)。后72℃延伸10min。
加等量酚-氯仿抽提，然后加10ul 3mol/l kac，250ul無水乙醇，置-70℃30min。
離心沉淀dna片段，用70%乙醇洗一次。
將沉淀dna干燥后溶于te緩沖液中，保存在-20℃。
3.制備抗體-親和素-dna復合物將*標記的抗體與親和素按等分子濃度混合于含有1mg/mlbsa的pbs中，室溫孵育30min，再加入兩倍分子濃度的*標記的dna片段，繼續(xù)孵育30min，后加入10倍分子濃度的*，將親和素分子上的結(jié)合部位飽和。后過凝膠過濾柱將復合物與未結(jié)合的單體分開，加入bsa達1mg/ml，分裝后凍存于-20℃。
4.免疫pcr
（1） 按常規(guī)elisa方法，用飽和緩沖液稀釋抗原，加到96孔塑料板或0.5mlpcr管中，4℃放置一晚。
（2） 用pbs洗三次，然后每孔加200ul封閉液（pbs含10mg/ml bsa，1mg/ml魚精dna），室溫孵育30min。
（3） 用tetbs（其配方：20mmol/l edta，0.02%nan3）洗三次。
（4） 將抗體-親和素-dna復合物稀釋于含有1mg/mlbsa和0.1mg/ml魚精dna的tetbs中，每孔加50ul，室溫孵育1h。
（5） 用tetbs洗5次，然后將塑料板或管倒置在吸水紙上拍打以控干水分。
（6） 每管中加50ulpcr反應液，含有表成分：
試 劑
添加量
終濃度
10×pcr緩沖液
5.0μl
1×
2.5mm 4dntp混合物
4.0μl
0.2mm
50um*標記的上游引物
0.5μl
0.5um
50um*標記的下游引物
0.5μl
0.5um
15mm模板dna
0.5μl
1.5ug
taq dna聚合酶
0.5μl
2.5u
加水至50μl
混勻后上面覆蓋液體石蠟。
95℃加熱5min，然后在pcr儀上按下列程序擴增35個循環(huán)：94℃ 1min;55℃ 1min; 72℃ 1min。后72℃延伸10min。
每管取5ul作瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，溴化乙錠染色后觀察結(jié)果，如在pcr時加入了放射性核素標記，則可用x光片顯影。
亦可在凝膠電泳后做southern-blot，用特異性探針雜交，進一步提高其特異性和敏感性。
(二)注意事項
本實驗的關鍵步驟是獲得適當?shù)目贵w-dna復合物。用鏈親和素將*標記的抗體與*標記的dna偶聯(lián)的方法，因每個鏈親和素分子可與四個*分子結(jié)合，因此要優(yōu)化反應條件，以使得每個鏈親和素分子既能結(jié)合上抗體分子，又能結(jié)合上dna片段。
此外，還可用化學方法將dna片段與抗體分子共價偶聯(lián)，即將抗體分子和5’端氨基酸修飾的dna片段分別用不同的雙功能偶聯(lián)劑激活，然后通過自發(fā)的反應偶聯(lián)到一起，比如，用n-succinimidyl-s-acetyl thioacetate(sata)活化氨基修飾的dna片段，用sulfo-succinimidyl4-(maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate(sulfo-smcc)修飾抗體分子，然后將二者在一小管中混合，通過加入鹽酸胲（hydroxylamine hydrochloride）使二者偶聯(lián)在一起。
免疫pcr具有高敏感性。因此，抗體和標記dna的任何非特異性結(jié)合均可導致嚴重的本底問題。因而在加入抗體和標記dna后必須盡可能*地清洗。即使有些特異性結(jié)合的抗體或標記dna被洗掉了，亦可在后通過增加pcr的循環(huán)次數(shù)得到彌補。此外，應用有效的封閉劑對防止非特異性結(jié)合也是非常重要的?？捎妹撝谭酆团Ｑ灏椎鞍鬃龅鞍追忾]劑，用魚精dna做核酸封閉劑。防止本底信號的另一個重要因素是控制污染，這也是所有敏感的檢測系統(tǒng)存在的問題。即使每一步試驗都做得非常認真，重復使用同樣的引物和標記dna均會產(chǎn)生假陽性信號。
免疫pcr的一個優(yōu)點是標記dna序列*是人為選定。因此標記dna及其引物可經(jīng)常變換，以避免由于污染造成的假陽性信號。
免疫pcr可以檢測到常規(guī)免疫學方法無法檢測的樣品。因此，應用免疫pcr可在微觀水平（單細胞）檢測抗原，定量pcr產(chǎn)物可以估計某一標本中的抗原數(shù)量，在臨床診斷中可在疾病早期抗原量很低時檢測到微量的抗原。