漲知識(shí) | 克隆專題七：分子克隆應(yīng)用工具克隆技術(shù)，又稱為“生物放大技術(shù)”，目前應(yīng)用 泛的技術(shù)為“分子克隆”，即通過重組技術(shù)將目的dna片段按照人們的設(shè)計(jì)定向連接起來，在特定的受體細(xì)胞中與載體同時(shí)復(fù)制并得到表達(dá)，產(chǎn)生新的遺傳性狀的技術(shù)。
大部分的分子克隆方法，諸如傳統(tǒng)分子克隆、ta克隆、gatway克隆、topo克隆、無縫克隆等都繞不開目的片段制備、載體制備、連接、轉(zhuǎn)化、篩選等等步驟。其中，設(shè)計(jì)引物、載體和片段，都需要使用相應(yīng)的分子克隆工具進(jìn)行操作和模擬，接下來小翌會(huì)以同源重組為例，具體解析一下分子克隆技術(shù)中應(yīng)用到的那些工具，為您的實(shí)驗(yàn)提供好方法。
01基因組序列查詢工具
進(jìn)行分子克隆實(shí)驗(yàn)之前，需要根據(jù)下游實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，確認(rèn)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用到的片段物種并查找序列。假設(shè)需要在自己的載體上加入人基因組dna，可以使用ncbi（干貨在線查詢，選擇“nucleotide”，輸入“human”，點(diǎn)擊查詢后，獲得5000多萬(wàn)條基因序列，如圖1所示。
圖1. ncbi基因序列查詢
點(diǎn)擊序列如智人kir3dl2蛋白的mrna序列（kir3dl2基因），進(jìn)入界面后會(huì)給出該基因的來源物種、詳細(xì)名稱、功能描述、文獻(xiàn)出處、核酸序列及氨基酸序列信息等信息。點(diǎn)擊右上角的“send to”可以獲得該基因的完整序列（純文本格式）。
圖2. ncbi基因序列下載
02目的片段和載體引物設(shè)計(jì)工具
獲得目的片段后，根據(jù)同源重組原理，需要在插入片段的上下游引入15-25 bp的同源臂，gc含量40-60%，以保證片段與載體充分接觸并進(jìn)行重組?？梢酝ㄟ^翌圣“支持中心”的“同源重組引物設(shè)計(jì)”點(diǎn)擊進(jìn)入，或者直接點(diǎn)擊無縫克隆引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)引物。輸入需要的載體序列和目的片段序列，選擇合適的酶切位點(diǎn)（不建議選擇載體和片段中都含有的酶切位點(diǎn)），生成引物，如圖3、4所示。
圖3. 翌圣設(shè)計(jì)軟件
圖4. 翌圣引物設(shè)計(jì)流程
值得注意的是，多個(gè)目的片段插入的雙酶切位點(diǎn)，實(shí)際添加到第一個(gè)片段的5’端和最后一個(gè)片段的3’端，中間片段不含有設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)。通過引物合成公司合成需要的引物序列。接著使用翌圣高保真pcr試劑盒（cat#10164es）pcr擴(kuò)增目的片段與載體。
03載體設(shè)計(jì)模擬軟件
當(dāng)設(shè)計(jì)完目的片段后，需要對(duì)載體和片段進(jìn)行模擬連接，保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。可以使用snapgene軟件模擬。以puc19為載體，kir3dl2基因?yàn)椴迦肫?，進(jìn)行克隆連接模擬。選擇“actions”—“gibson assembly”—“insert fragment”，輸入相應(yīng)的插入片段和載體序列，如下圖5所示，即可生成連接后的載體。點(diǎn)擊新生成載體的“history”可以模擬載體與片段連接的具體步驟，如圖6所示。
圖5. snapgene同源重組模擬流程
圖6. snapgene同源重組模擬圖
模擬步驟后，即可使用翌圣新品通用型多片段快速克隆試劑盒（cat#10923es）連接目的片段，該試劑盒滿足6 μl小體系、10 ng低濃度載體與片段的連接，菌落數(shù)多，克隆陽(yáng)性率高，客戶反饋效果好，如圖7所示。
小體系低濃度載體高效率重組實(shí)驗(yàn)信息：載體大?。?369 bp；目的片段大小：1589 bp。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：
圖7.10923es在10 μl小反應(yīng)體系下，低濃度載體（30 ng）連接單片段，陽(yáng)性率100%。a：重組轉(zhuǎn)化平板。b：插入片段pcr鑒定電泳圖，泳道1-5分別為菌落1，菌落2，陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照（基因組作為模版），陽(yáng)性對(duì)照（pcr純化片段作為模版）。（上海交通大學(xué)）
除了上述基礎(chǔ)的分子克隆技術(shù)應(yīng)用工具外，還有如紐約大學(xué)研究人員開發(fā)的grna在線設(shè)計(jì)軟件 ，用于設(shè)計(jì)crispr-cas13的grna引物等。分子克隆應(yīng)用工具多種多樣，應(yīng)用好工具，能為我們的實(shí)驗(yàn)添磚加瓦。小翌在這里祝您實(shí)驗(yàn)順利，一氣呵成！關(guān)注我們，小翌會(huì)在下一期繼續(xù)帶來分子克隆方面的知識(shí)，為您的實(shí)驗(yàn)帶來新的思路與方向，期待下一次的見面~
04相關(guān)產(chǎn)品列表
產(chǎn)品定位
產(chǎn)品名稱
產(chǎn)品貨號(hào)
規(guī)格
高保真pcr
2× hieff canace® advancefast pcr master mix (with dye)
10164es03/08
1 ml/5×1 ml
1-7片段一步法定向連接，最快5分鐘完成重組反應(yīng)
hieff clone® universal ii one step cloning kit
10923es20/50
20 t/50 t
通用緩沖液，5min完成精準(zhǔn)酶切
funicut™快速限制性內(nèi)切酶
15001es-15051es
50 t
快速pcr，快至1s/kb
2×hieff®ultra-rapid hotstart pcr master mix(with dye)
10157es03/08
1 ml/5×1 ml