什么是免疫組織化學(xué)
免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry), 是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理---抗原抗體反應(yīng), 即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理, 通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì)), 對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究技術(shù)。
免疫組化將免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性巧妙地結(jié)合起來(lái), 借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用, 在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測(cè)各種抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體及受體等)。
免疫組化標(biāo)本
實(shí)驗(yàn)所用主要為組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類, 前者包括石蠟切片和冰凍切片, 后者包括組織印片、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片。
其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本最-常-用、最基本的方法, 對(duì)于組織形態(tài)保存好, 且能作連續(xù)切片, 有利于各種染色對(duì)照觀察; 還能長(zhǎng)期存檔, 供回顧性研究。石蠟切片制作過(guò)程對(duì)組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響, 但可進(jìn)行抗原修復(fù), 是免疫組化中首-選的組織標(biāo)本制作方法。
免疫組化檢測(cè)方法
>>直接法
直接法又稱一步法, 采用帶標(biāo)記的抗體(如fitc)直接作用于組織切片上的抗原。該技術(shù)僅需一種抗體, 流程簡(jiǎn)短、快速。但因?yàn)闆](méi)有信號(hào)放大系統(tǒng), 直接法靈敏度不高。隨著間接法的引入, 直接法應(yīng)用逐漸減少。
>>pap法
pap(peroxidase anti-peroxidase), 即過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶法。該法是間接法的進(jìn)一步改進(jìn), 涉及第三層過(guò)氧化物酶標(biāo)記的過(guò)氧化物酶抗體。該抗體與第二層未標(biāo)記抗體結(jié)合。因?yàn)檫^(guò)氧化物酶分子不是通過(guò)化學(xué)方法與igg結(jié)合而是通過(guò)免疫結(jié)合, 故靈敏度高出100-1000倍。pap法一抗的稀釋倍數(shù)增高, 可減少非特異性的背景染色。
>>abc法
abc(avidin-biotin-complex)代表的是親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物。利用親和素分別連接生物素標(biāo)記的第二抗和生物素標(biāo)記的酶。但是此法注意內(nèi)源性生物素活性的消除, 以減少非特異性的染色。
>>間接法
間接法涉及一個(gè)未標(biāo)記的一抗(第一層，直接跟組織抗原反應(yīng))和一個(gè)標(biāo)記的二抗(第二層, 與一抗反應(yīng))。因?yàn)槎箍筛豢股隙鄠€(gè)不同的抗原位點(diǎn)結(jié)合, 放大信號(hào), 從而提高了該法的靈敏度。當(dāng)二抗標(biāo)記上熒光染料, 如fitc、羅丹明、德克薩斯紅等, 即是間接免疫熒光法。當(dāng)二抗標(biāo)記上酶, 如過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或葡萄糖氧化酶, 即是間接免疫酶法。
>>sp法
sp(streptavidin-perosidase)法, 即鏈親和素-過(guò)氧化物酶連結(jié)法, 是采用生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈親和素連接的過(guò)氧化物酶及底物色素混合液來(lái)測(cè)定細(xì)胞或組織中的抗原。鏈親和素是一種金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁分離的蛋白質(zhì), 它能與各種動(dòng)物的igg的fc段結(jié)合, 在免疫組化中可作為橋連抗體或標(biāo)記抗體。最大的優(yōu)點(diǎn)是不受種屬的特異性限制。此法還具有染色時(shí)間短、靈敏度高、背景染色淡等優(yōu)點(diǎn), 分子量小, 易于穿透組織。
※ abc法 vs sp法
abc法的'三抗'是sabc復(fù)合物即鏈酶親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物
sp法的'三抗'是過(guò)氧化物酶直接與鏈酶親和素相連的, 沒(méi)有通過(guò)生物素的中介連接
免疫組化常用染色方法
根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法、免疫酶標(biāo)法和免疫膠體金技術(shù)。
>>免疫熒光法 >>免疫酶標(biāo)法 >>免疫膠體金法
免疫熒光染色是最早出現(xiàn)的免疫組化的染色方法?；诳乖贵w的免疫反應(yīng), 結(jié)合抗原的帶熒光標(biāo)記的抗體在熒光顯微鏡下通過(guò)特殊波段的激發(fā)從而發(fā)出熒光, 以此定位結(jié)合抗原的位置。免疫熒光因其高靈敏性、特異性、簡(jiǎn)便性, 被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)分析和診斷。
在免疫酶染色法中, 酶標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞內(nèi)的特異性抗原相結(jié)合。加入酶顯色底物后, 形成不可溶性物質(zhì), 通過(guò)顯微鏡
可觀察定位。
免疫膠體金法采用膠體金作為標(biāo)記物, 這種特殊的金屬離子呈膠體形式, 可快速穩(wěn)定地結(jié)合蛋白質(zhì)。此外, 膠體金幾乎不影響天然蛋白質(zhì)的生物活性。因此膠體金是一種理想的材料, 用于結(jié)合一抗、二抗或其他蛋白的igg部位, 從而定位組織或培養(yǎng)細(xì)胞上的特定抗原。由于膠體金離子的大小和電子密度不同, 免疫膠體金法可適用于免疫電子顯微鏡或光學(xué)顯微鏡下單或多標(biāo)記檢測(cè)。
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