關(guān)于elisa
酶免疫測(cè)定（enzymeimmunoassay）可分為均相（homogenous）和非均相（heterogenous）兩種類型。在均相eia中可不需進(jìn)行游離的和結(jié)合的標(biāo)記物的分離而直接測(cè)定標(biāo)記物。例如在某種條件下，抗原抗體反應(yīng)后形成的酶標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物中的酶失去其對(duì)底物作用的活力，因而測(cè)出的酶活力直接反映游離的酶標(biāo)記物。均相eia在臨床檢驗(yàn)中較少應(yīng)用。非均相eia需先進(jìn)行游離的和結(jié)合的標(biāo)記物的分離。如前所述，固相載體可用作一種分離手段。這種固相酶免疫測(cè)定方法在1971年最初建立時(shí)稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（enzymelinkedimmunosorbentassay），簡(jiǎn)稱elisa，在國(guó)內(nèi)有譯作酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)或酶標(biāo)，已習(xí)用。
elisa的原理
elisa的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開(kāi)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。
elisa的類型
elisa可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑：（1）_clb_fillslot（'920966'）；固相的抗原或抗體，即“免疫吸附劑”（immunosorbent）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為“酶聯(lián)物”、“結(jié)合物”（conjugate）；（3）酶反應(yīng)的底物。根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的情況以及檢測(cè)的具體條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。用于臨床檢驗(yàn)的elisa主要有以下幾種類型：
1、雙抗體夾心法測(cè)抗原
雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原zui常用的方法，操作步驟如下：
1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
2）加受檢標(biāo)本，保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。
3）加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。
4）加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過(guò)比色，測(cè)知標(biāo)本中抗原的量。在臨床檢驗(yàn)中，此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如hbsag、hbeag、afp、hcg等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。如抗體的來(lái)源為抗血清，包被和酶標(biāo)用的抗體最好分別取自不同種屬的動(dòng)物。如應(yīng)用單克隆抗體，一般選擇兩個(gè)針對(duì)抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體一起保溫反應(yīng)，作一步法檢測(cè)。在一步法測(cè)定中，當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時(shí)，過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成“夾心復(fù)合物”。類同于沉淀反應(yīng)中抗原過(guò)剩的后帶現(xiàn)象，此時(shí)反應(yīng)后顯色的吸光值（位于抗原過(guò)剩帶上）與標(biāo)準(zhǔn)曲線（位于抗體過(guò)剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測(cè)讀，所得結(jié)果將低于實(shí)際的含量，這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應(yīng)（hookeffect），因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線到達(dá)高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)，反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此在使用一步法試劑測(cè)定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中hbsag、afp和尿液hcg等）時(shí)，應(yīng)注意可測(cè)范圍的最高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng)。假使在被測(cè)分子的不同位點(diǎn)上含有多個(gè)相同的決定簇，例如hbsag的a決定簇，也可用針對(duì)此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結(jié)合物。但在hbsag的檢測(cè)中應(yīng)注意亞型問(wèn)題，hbsag有adr、adw、ayr、ayw4個(gè)亞型，顯然每種亞型均有相同的a決定簇的反應(yīng)性，這也是用單抗作夾心法應(yīng)注意的問(wèn)題。雙抗體夾心法測(cè)抗原的另一注意點(diǎn)是類風(fēng)濕因子（rf）的干擾。rf是一種自身抗體，多為igm型，能和多種動(dòng)物igg的fc段結(jié)合。用作雙抗體夾心法檢測(cè)的血清標(biāo)本中如含有rf，它可充當(dāng)抗原成份，同時(shí)與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合，表現(xiàn)出假陽(yáng)性反應(yīng)。采用f（ab'）或fab片段作酶結(jié)合物的試劑，由于去除了fc段，從而可消除rf的干擾。雙抗體夾心法elisa試劑是否受rf的影響，已被列為這類試劑的一項(xiàng)考核指標(biāo)。雙抗體夾心法適用于測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能baidu_clb_fillslot（'920970'）；形成兩位點(diǎn)夾心醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)`搜集整理。
2、雙抗原夾心法測(cè)抗體反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測(cè)相應(yīng)的抗體。與間接法測(cè)抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗hbs的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。
3、間接法測(cè)抗體
間接法是檢測(cè)抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：
1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。
2）加稀釋的受檢血清，保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過(guò)程中被洗去。
3）加酶標(biāo)抗抗體?？捎妹笜?biāo)抗人ig以檢測(cè)總抗體，但一般多用酶標(biāo)抗人igg檢測(cè)igg抗體。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合，從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān)。
4）加底物顯色本法主要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。雖然有時(shí)用粗提抗原包被也能取得實(shí)際有效的結(jié)果，但應(yīng)盡可能予以純化，以提高試驗(yàn)的特異性。特別應(yīng)注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應(yīng)的雜質(zhì)，例如以e.coli為工程酶的重組抗原，如其中含有e.coli成份，很可能與受過(guò)e.coli感染者血清中的抗e.coli抗體發(fā)生反應(yīng)?？乖幸膊荒芎信c酶標(biāo)抗人ig反應(yīng)的物質(zhì)，例如來(lái)自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的ig去除，試驗(yàn)中也發(fā)生假陽(yáng)性反應(yīng)。另外如抗原中含有無(wú)關(guān)蛋白，也會(huì)因竟?fàn)幬蕉绊懓恍Чｉg接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性抗體。病人血清中受檢的特異性igg只占總igg中的一小部分。igg的吸附性很強(qiáng)，非特異igg可直接吸附到固相載體上，有時(shí)也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被后一般用無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空余間隙。另外，在檢測(cè)過(guò)程中標(biāo)本須先行稀釋（1：40~1：200），以避免過(guò)高的陰性本底影響結(jié)果的判斷。
4、競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體
當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽(yáng)性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會(huì)有干擾物質(zhì)，直接包被不易成功，可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體，然后加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質(zhì)，然后再加標(biāo)本和酶標(biāo)抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)。競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體有多種模式，可將標(biāo)本和酶標(biāo)抗體與固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，抗hbcelisa一般采用此法。另一種模式為將標(biāo)本與抗原一起加入到固相抗體中進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)抗體，與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)。抗hbe的檢測(cè)一般采用此法。
5、競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等elisa測(cè)定多用此法。
6、捕獲包被法測(cè)抗體（經(jīng)典方法）
igm抗體的檢測(cè)用于傳染病的早期診斷中。間接法elisa一般僅適用于檢測(cè)總抗體或igg抗體。如用抗原包被的間接法直接測(cè)定igm抗體，因標(biāo)本中一般同時(shí)存在較高濃度的igg抗體，后者將競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相抗原而使一部份igm抗體不能結(jié)合到固相上。因此如用抗人igm作為二抗，間接測(cè)定igm抗體，必須先將標(biāo)本用a蛋白或抗igg抗體處理，以除去igg的干擾。在臨床檢驗(yàn)中測(cè)定抗體igm時(shí)多采用捕獲包被法。先用抗人igm抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的igm（其中包括針對(duì)抗原的特異性igm抗體和非特異性的igm）。然后加入抗原，此抗原僅與特異性igm相結(jié)合。繼而加酶標(biāo)記針對(duì)抗原的特異性抗體。再與底物作用，呈色即與標(biāo)本中的igm成正相關(guān)。此法常用于病毒性感染的早期診斷。類風(fēng)濕因子（rf）同樣能干擾捕獲包被法測(cè)定igm抗體，導(dǎo)致假陽(yáng)性反應(yīng)。因此中和igg的間接法近來(lái)頗受青睞，用這類試劑檢測(cè)抗cmviggm和抗弓形蟲igm抗體已獲成功醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)`搜集整理。
7、abs-elisa法abs為親和素（avidin）生物素（biotin）系統(tǒng)（system）的略語(yǔ)。親和素是一種糖蛋白，分子量60000，每個(gè)分子由4個(gè)能和生物素結(jié)合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子量244.用化學(xué)方法制成的衍生物素-羥基琥珀酰亞胺酯可與蛋白質(zhì)和糖等多種類型的大小分子形成生物素標(biāo)記產(chǎn)物，標(biāo)記方法頗為簡(jiǎn)便。生物素與親和素的結(jié)合具有很強(qiáng)的特異性，其親和力較抗原抗體反應(yīng)大得多，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于一個(gè)親和素可與4個(gè)生物素分子結(jié)合，因此如把a(bǔ)bs與elisa法可分為酶標(biāo)記親和素-生物素（lab）法和橋聯(lián)親和素-生物素（abc）法兩種類型。兩者均以生物素標(biāo)記的抗體（或抗原）代替原elisa系統(tǒng)中的酶標(biāo)抗體（抗原）。在lab中，固相生物素先與不標(biāo)記的親和素反應(yīng)，然后再加酶標(biāo)記
的生物素以進(jìn)一步提高敏感度。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為堿性糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強(qiáng)，用于elisa中可使本底增高。從鏈霉菌中提取的鏈霉親和素則無(wú)此缺點(diǎn)，在elisa應(yīng)用中有替代前者的趨勢(shì)。由于abs-elisa較普通elisa多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗(yàn)中abs-elisa應(yīng)用不多。科研項(xiàng)目中檢測(cè)微量的成分如細(xì)胞因子常采用本法。
關(guān)鍵詞：吸附劑