“生物過(guò)程是發(fā)現(xiàn)和制備藥物、特殊化學(xué)品、大宗能源及化學(xué)品的重要手段。先進(jìn)的檢測(cè)及控制技術(shù)的缺乏極大限制了發(fā)酵過(guò)程的產(chǎn)率及產(chǎn)能，也對(duì)于發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)量有重要影響。原位拉曼光譜技術(shù)是一種可靠的pat方法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)于發(fā)酵過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物、代謝物和產(chǎn)物以及細(xì)胞生長(zhǎng)參數(shù)等指標(biāo)的在線檢測(cè)。在線過(guò)程分析技術(shù)帶來(lái)的豐富數(shù)據(jù)可以進(jìn)一步提升發(fā)酵過(guò)程工藝水平，并最終實(shí)現(xiàn)qbd（質(zhì)量源于設(shè)計(jì)）。”
細(xì)胞培養(yǎng)是培養(yǎng)細(xì)胞獲取重組蛋白、抗體等生物大分子生產(chǎn)中的過(guò)程，這一過(guò)程直接影響到產(chǎn)品的產(chǎn)量及質(zhì)量。由于細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境及培養(yǎng)策略會(huì)直接影響細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，為保證細(xì)胞正常生長(zhǎng)、提高產(chǎn)量及保證產(chǎn)品質(zhì)量，必須監(jiān)控細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程。
目前，一般只對(duì)發(fā)酵過(guò)程的工藝參數(shù)，如ph、溫度、溶氧(do)、攪拌速度等進(jìn)行在線檢測(cè)和控制，而與產(chǎn)品質(zhì)量密切相關(guān)的生化指標(biāo)仍采用取樣分析方式。傳統(tǒng)的離線取樣存在取樣時(shí)間間隔較長(zhǎng)、分析繁瑣等問(wèn)題，難以滿足細(xì)胞生長(zhǎng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)與分析要求，因此亟需開(kāi)發(fā)發(fā)酵過(guò)程中生化指標(biāo)的離線快速檢測(cè)或在線檢測(cè)方法。
圖1 發(fā)酵過(guò)程及關(guān)鍵工藝參數(shù)和相關(guān)技術(shù)指標(biāo)的檢測(cè)
pat技術(shù)加速生物過(guò)程工藝開(kāi)發(fā)和優(yōu)化
過(guò)程分析技術(shù)（pat）是美國(guó)食品和藥物管理局（fda）與歐洲藥品管理局（ema）倡導(dǎo)的制藥行業(yè)工藝研究與生產(chǎn)的技術(shù)。pat的本質(zhì)是通過(guò)實(shí)時(shí)測(cè)量原料、過(guò)程中物料以及過(guò)程本身的關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)來(lái)實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)過(guò)程的設(shè)計(jì)、分析和控制。實(shí)施pat能夠簡(jiǎn)化分析過(guò)程，為生物制造過(guò)程提供連續(xù)的工作流程，并為提前發(fā)現(xiàn)和解決問(wèn)題創(chuàng)造可能性。
在線光譜技術(shù)是一種現(xiàn)實(shí)可行的pat策略，可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)過(guò)程展示，在線參數(shù)監(jiān)測(cè)以及過(guò)程反饋控制。常見(jiàn)的在線光譜分析方法包括在線近紅外 (near-infrared，nir)、在線中紅外(mid-infrared，mir)、在線拉曼（raman）光譜等。
圖2梅特勒托利多在線光譜儀：reactir™ ftir（傅里葉變換）光譜儀和reactraman™原位拉曼光譜儀
水是細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分，在近紅外光譜和中紅外光譜中吸收較強(qiáng)，培養(yǎng)液中其他成分的紅外光譜信息很容易被水的吸收峰掩蓋。而水的拉曼信號(hào)較弱，相比于紅外光譜，拉曼光譜更適合于水體系的分析，其能提供更高特異性的分子指紋信息。因此，拉曼光譜更適合用于生物過(guò)程的分析和應(yīng)用。
拉曼光譜技術(shù)可原位同步分析發(fā)酵過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物、代謝物和產(chǎn)物的組分濃度變化，借助化學(xué)計(jì)量學(xué)數(shù)學(xué)模型，甚至可實(shí)現(xiàn)同步監(jiān)測(cè)活細(xì)胞密度（vcd）、總細(xì)胞密度（tcd）、細(xì)胞活率（vib）等生化指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)生物過(guò)程的實(shí)時(shí)在線過(guò)程監(jiān)測(cè)。
圖3拉曼光譜技術(shù)可實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程的原位在線監(jiān)控
部署reactraman™ 原位拉曼光譜儀，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程“可視化”reactraman™原位拉曼光譜儀可以在幾秒鐘內(nèi)收集和分析光譜，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物過(guò)程的密切監(jiān)控。在定量模型的基礎(chǔ)上，研究人員可以對(duì)多參數(shù)進(jìn)行快速和同時(shí)檢測(cè)；甚至在整合入生物反應(yīng)器后，完成某一關(guān)鍵參數(shù)或物料流加的反饋控制循環(huán)。
多參數(shù)快速檢測(cè)基于所關(guān)注參數(shù)的定量模型，只需根據(jù)時(shí)刻點(diǎn)的光譜數(shù)據(jù)即可獲取該時(shí)刻下對(duì)應(yīng)的所關(guān)注指標(biāo)的數(shù)值。相比于傳統(tǒng)的離線分析方法，拉曼光譜法可以大大縮短分析時(shí)間，這對(duì)于研發(fā)人員和分析儀器資源的優(yōu)化具有重要意義。很少的取樣量（低至1ml）即可完成對(duì)于多種參數(shù)的同時(shí)快速檢測(cè)。
圖4使用reactraman™原位拉曼光譜儀建立的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程葡萄糖濃度和活細(xì)胞密度的過(guò)程趨勢(shì)圖
原位實(shí)時(shí)監(jiān)控發(fā)酵體系的原位監(jiān)測(cè)日益成為行業(yè)關(guān)注的方向。生物反應(yīng)器廣泛用于整個(gè)生物制藥行業(yè)，例如單克隆抗體的制造。在發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞代謝水平可能隨時(shí)發(fā)生波動(dòng)，代謝物水平可能會(huì)明顯改變，取樣分析帶來(lái)的滯后性會(huì)錯(cuò)過(guò)這些過(guò)程的表征。
reactraman™ 802原位拉曼光譜儀可輕松與生物反應(yīng)器整合。只需將探頭插入反應(yīng)器中，在高溫蒸汽滅菌之后，即可對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行全過(guò)程連續(xù)監(jiān)測(cè)。從過(guò)往研究與實(shí)際項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)來(lái)看，葡萄糖濃度、乳酸濃度、谷氨酸濃度、谷氨酰胺濃度、乳酸脫氫酶濃度，活細(xì)胞密度(vcd)、總細(xì)胞密度(tcd)、細(xì)胞活率(vib)等多個(gè)指標(biāo)參數(shù)的在線監(jiān)測(cè)均可通過(guò)這種方法實(shí)現(xiàn)。
圖5 使用reactraman™原位拉曼光譜儀獲得的同一發(fā)酵過(guò)程的多種參數(shù)過(guò)程趨勢(shì)圖
對(duì)于全過(guò)程的連續(xù)監(jiān)測(cè)提供了豐富的信息，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于取樣分析的數(shù)據(jù)量有助于提升我們對(duì)于發(fā)酵過(guò)程這一“暗室”的充分“可視化”，提升整個(gè)工藝的自動(dòng)化和數(shù)字化水平。理論上，reactraman™ 802原位拉曼光譜儀可以幫助避免發(fā)酵過(guò)程的任何異常情況，確保生物反應(yīng)器始終處于最優(yōu)的操作條件。工作人員借助實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)可做出快速?zèng)Q策，從而實(shí)現(xiàn)更高的產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量。