北京時間10月2日，備受矚目的“2023年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎”被授予科學家drew weissman和katalin karikó，以表彰他們在mrna疫苗領域的杰出貢獻。
在新冠爆發(fā)之前，mrna疫苗對大多數(shù)人來說還是一個相對陌生的概念。這種疫苗是通過編碼病原體某個蛋白組分的基因序列的mrna，在體內(nèi)表達成蛋白質(zhì)進行抗原呈遞，并具有自佐劑作用。相比其他疫苗，mrna疫苗具有“即插即用”的優(yōu)勢，只需知道病原體結(jié)構(gòu)蛋白的基因序列就可以進行大規(guī)模生產(chǎn)。此外，它還能在體內(nèi)引發(fā)強烈的免疫應答，并產(chǎn)生高滴度的抗體。接下來，讓我們一起看看兩位諾獎得主在2018年發(fā)表的一篇文章[1]，以更好的理解mrna疫苗到底有多牛！
這篇文章對mrna疫苗的研究非常全面:
涉及了流感疫苗、hiv疫苗和寨卡疫苗
包含小鼠和靈長類動物實驗
從體液應答和細胞免疫應答等方面對疫苗進行評估
m1ψ-mrna-lnp
可長時間有效地生產(chǎn)蛋白質(zhì)
1-甲基假尿苷（m1ψ）修飾mrna，可以防止mrna疫苗在體內(nèi)產(chǎn)生炎癥反應，同時還能提高蛋白質(zhì)的表達效率。這是兩位諾貝爾獎獲得者對mrna疫苗做出的重要改進之一。接下來，我們來看一下這種改進帶來的實驗結(jié)果：
圖1.相對與未修飾的mrna-lnp，編碼熒光素酶（luc）的m1ψ-mrna-lnp的翻譯水平較高，并可以維持13天的蛋白質(zhì)表達
小鼠細胞免疫評估
圖2.相比于對照mrna、滅活流感病毒疫苗以及未修飾mrna疫苗，m1ψ修飾的ha mrna疫苗（編碼流感病毒ha蛋白）能產(chǎn)生更強的抗原特異性cd4+細胞免疫應答
對于cd8+細胞免疫應答結(jié)果也類似。ha mrna疫苗免疫后，總脾gc（生發(fā)中心）b細胞大幅增加（約8-59倍），單次免疫后8天脾漿細胞的數(shù)量也增加，并顯著增加了脾臟中tfh細胞（濾泡輔助性t細胞）總數(shù)
小鼠抗體評估
流感疫苗誘導的抗體滴度主要通過血凝抑制（hai）測定法來測量。在這種方法種，1:40的體外hai滴度被認為可以保護人類免受流感感染。在接種ha mrna疫苗單次免疫后，在2周觀察到640的hai滴度，在4周時這個數(shù)值增加到2000。
圖3.在體液免疫應答方面，mrna疫苗所產(chǎn)生的抗體滴度是最高的，并且能持續(xù)至少一年不降低
在靈長類動物實驗中，編碼寨卡病毒prm-e蛋白的mrna疫苗，也產(chǎn)生了持續(xù)一年的高滴度抗體。
抗體親和力測定
由于tfh細胞促進親和力成熟，小鼠單次免疫ha mrna疫苗后多克隆抗體的親和力是重要表征模型。而高滴度不一定意味著高親和力，所以在這篇文章中，作者使用賽多利斯octet® 非標記分子互作系統(tǒng)來檢測血清中多克隆抗體的親和力！首先使用amc傳感器（anti-mouse igg）固化血清中的抗體，與31.25nm的ha進行結(jié)合解離，并用ph2.5的甘氨酸進行再生，然后用1:1模型擬合獲得kd值（平衡解離常數(shù)）。
在接種疫苗2周后，產(chǎn)生的抗體親和力隨著接種時間增加而增加，4周的時候kd值為362pm,8周的時候為6pm。相比之下，使用未修飾的mrna或滅活的流感病毒顆粒免疫的小鼠中抗體的親和力低得多。tfh細胞反應通過體細胞超突變驅(qū)動親和力成熟；但是需要進一步對ig可變基因進行測序，并檢測純化的單克隆抗體的親和力。
圖4.octet® 測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)：mrna疫苗免疫時間越長，抗體親和力越高；縱坐標為kd值（單位nm）
圖5.相對于未修飾的mrna疫苗（中）和滅活疫苗（右），修飾的mrna疫苗（左）的親和力最高
高親和力抗體的產(chǎn)生是中和多種病原體的基礎。這項研究證明了m1ψ-mrna-lnp疫苗能夠產(chǎn)生針對流感病毒、zikv和hiv-1的高滴度、高親和力和持續(xù)性中和抗體的能力。
輝瑞和biontech的mrna疫苗（bnt162b2）
卡里科博士作為biontech公司的高級副總裁，在新冠爆發(fā)后，引領了新冠mrna疫苗的問世。
它是一個大規(guī)模使用的新冠mrna疫苗。在其遞交給歐洲藥物管理局（ema）的評估報告[2]和發(fā)表的nature研究性文章[3]中均提到：
利用octet® 非標記分子互作系統(tǒng)（bli技術）來測定mrna表達產(chǎn)物的結(jié)合活性。通過生物傳感器分別固化ace2和抗體，與293t細胞中表達的不同濃度的s蛋白（疫苗表達產(chǎn)物）進行親和力測定。兩者的親和力均在nm級別，符合正常s蛋白與受體及中和抗體的結(jié)合能力，并以此作為疫苗功能確認的指標之一。
在其公布臨床前研究中可發(fā)現(xiàn)，該疫苗編碼的是s蛋白，其中986/987位氨基酸殘基突變成了脯氨酸，與野生型s蛋白相比，不會與細胞膜融合，維持了融合前構(gòu)象。該疫苗的表達產(chǎn)物保持了與受體ace2以及一種rbd中和抗體的親和力。同時，還同時設計了其他序列，一起與bnt162b2平行比較，最終選擇了bnt162b2作為候選mrna新冠疫苗。
我們都知道，從分子生物學的角度來看，rna是一種非常不穩(wěn)定的分子。然而，通過幾十年的技術積累，科學家們成功的將rna做成一類疫苗，并在新冠疫情種拯救了數(shù)以千萬計的生命。這也就是為什么這次諾貝爾醫(yī)學獎眾望所歸的原因吧。
你知道嗎？連續(xù)四年的諾貝爾獎獲得者都曾使用octet® 非標記分子互作系統(tǒng)進行研究，并發(fā)表了文章：
2020-2022
好馬配好鞍，推薦兩個來自2022年諾獎得主的實驗神器！
2021諾貝爾獎得主教你用bli技術“感知痛覺”！
2020諾獎獲得者教你做分子互作競爭實驗
使用octet® 非標記分子互作系統(tǒng)的優(yōu)勢？
非標記direct binding是趨勢，它的親和力測試結(jié)果更準確
快速測定親和力，更加定量化對互作進行表征
無洗滌步驟，可測弱親和力（解離快）
測試時間短，一般10-20分鐘，更快拿到結(jié)果
實驗形式多樣化：定性，兩者結(jié)合，協(xié)同/競爭實驗，垂釣
寫入了美國藥典，文章多于13,000篇，認可度廣
萬金油技術，可以用于檢測dna、小分子、蛋白等各種生物分子
使用方便，成本相對低，對粗樣品耐受性好；比如本文就直接檢測小鼠血清抗體
通量大；本文就用octet® 檢測了十幾個小鼠樣本（多濃度）
生物層干涉技術應用文集
——病毒學基礎研究及藥物研發(fā)
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