小鼠苗條素受體(lr/ob-r）elisa試劑盒課題研究
小鼠苗條素受體(lr/ob-r）elisa試劑盒實(shí)驗(yàn)原理
小鼠苗條素受體(lr/ob-r）elisa試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（elisa）。往預(yù)先包被小鼠苗條素受體(lr/ob-r）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、hrp標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)溫育并徹di洗滌。用底物tmb顯色，tmb在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的小鼠苗條素受體(lr/ob-r）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（od 值），計(jì)算樣品濃度。
樣本處理及要求
1. 血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2. 血漿：用edta或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3. 組織勻漿：用預(yù)冷的pbs (0.01m, ph=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的pbs（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9ml的pbs，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在pbs中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測(cè)。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請(qǐng)1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注：標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。
需要而未提供的試劑盒器材
1.酶標(biāo)儀（450nm）
2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10ul、2-20ul、20-200ul、200-1000ul
3.37℃恒溫箱
4.蒸餾水或去離子水
名稱
96孔配置
48孔配置
備注
微孔酶標(biāo)板
8孔×12條
8孔×6條
無(wú)
標(biāo)準(zhǔn)品
0.3ml*6管
0.3ml*6管
無(wú)
樣本稀釋液
6ml
3ml
無(wú)
檢測(cè)抗體-hrp
10ml
5ml
無(wú)
20×洗滌緩沖液
25ml
15ml
按說(shuō)明書進(jìn)行稀釋
底物a
6ml
3ml
無(wú)
底物b
6ml
3ml
無(wú)
終止液
6ml
3ml
無(wú)
封板膜
2張
2張
無(wú)
說(shuō)明書
1份
1份
無(wú)
自封袋
1個(gè)
1個(gè)
無(wú)
備注：
1、標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：詳見說(shuō)明書；
2、經(jīng)過(guò)大量正常標(biāo)本檢驗(yàn)，標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測(cè)范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中直接取50μl樣本上樣即可。當(dāng)有部分樣本值超過(guò)最大標(biāo)準(zhǔn)品濃度時(shí)，可用樣本稀釋液將標(biāo)本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
注意事項(xiàng)
1、嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
2、洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過(guò)程中不要讓微孔干燥掉。
3、消除板底殘留的液體和手指印，否則影響od值。
4、底物顯色液應(yīng)呈無(wú)色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。
5、避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果。
6、在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。
7、平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
8、任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體。任何漂白成分都會(huì)破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。
9、不能使用過(guò)期產(chǎn)品。
10、如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測(cè)裝置。
試劑準(zhǔn)備
試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。
操作步驟
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μl；
3.樣本孔中加入待測(cè)樣本50μl；空白孔不加。
4.除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（hrp）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μl，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μl），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。
6.每孔加入底物a、b各50μl，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入終止液50μl，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的od值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算
以所測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的od值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的od值代入方程，計(jì)算出樣品的濃度。
試劑盒性能
1、檢測(cè)范圍：詳見產(chǎn)品說(shuō)明書。
2、靈敏度：最di檢測(cè)濃度小于0.1u/l。
3、特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
4、重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于15%。